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外切-β-1，4-葡聚糖酶試劑盒說明書

僅供研究用
貨號：QYS-235045
外切-β-1，4-葡聚糖酶（C1）活性測定試劑盒說明書

外切-β-1，4-葡聚糖酶試劑盒說明書分光光度法 50 管/24 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

C1（EC3.2.1.91）存在于細菌、真菌和動物體內(nèi)，是纖維素酶系的組份之一，C1催化多聚糖鏈的末端非還原端釋放出纖維二糖和葡萄糖。

測定原理：

采用3,5－二硝基水楊酸法測定C1催化微晶纖維素降解產(chǎn)生的還原糖的含量。

外切-β-1，4-葡聚糖酶試劑盒說明書需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、水浴鍋、離心機、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；試劑一：液體 15mL×1 瓶，4℃保存；試劑二：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

樣品測定的準備：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。3、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：

1、 分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

試劑名稱（μL）        測定管        對照管
樣本        50        50
試劑一        500        
蒸餾水                500
        混勻，37℃準確水浴 2h    
試劑二    1000        1000
                

混勻， 90℃水浴 10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，測 540nm 下吸光值 A，計算 ΔA=A 測定管-A 對照管。每個測定管需設(shè)一個對照管。
C1 活性計算

1、標準條件下測定回歸方程為 y = 6.4078x - 0.0673；x 為標準品濃度（mg/mL），y 為吸光值。

2、血清（漿）C1 活力的計算

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

C1 活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反總]÷V 樣÷T

=14.305×(ΔA+0.0673)
3、細胞、細菌和組織中 C1 活力的計算（1）按照蛋白濃度計算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

C1 活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

C1 活力(μg /min /g 鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W

外切-β-1，4-葡聚糖酶試劑盒說明書（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

C1 活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.0286×(ΔA+0.0673)

1000：1mg/mL=1000ug/mL；V 反總：反應體系總體積，0.55mL； V 樣：加入樣本體積，

0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，120 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。