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正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：                                      

氧自由基作用于脂質(zhì)的不飽和脂肪酸，生成過氧化脂質(zhì)；后者逐漸分解為一系列復雜的化合物，其中包括MDA。通過檢測MDA的水平即可檢測脂質(zhì)氧化的水平。

測定原理：

MDA與硫代巴比酸(thiobarbituric acid，TBA)縮合，生成紅色產(chǎn)物，在532nm有最大吸收峰，進行比色后可估測樣品中過氧化脂質(zhì)的含量；同時測定600nm下的吸光度，利用532nm與600nm下的吸光度的差值計算MDA的含量。 

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配置：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體30mL×1瓶，4℃保存；

注意事項：

臨用前注意試劑一是否溶解，如未溶解，可以70℃-90℃加熱，并振蕩以促進溶解。

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1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、吸取0.3mL 試劑一于1.5mL離心管中，再加入0.1mL樣本, 混勻。

2、95℃水浴中保溫30min（蓋緊，防止水分散失），置于冰浴中冷卻，10000g，25℃，離心10min。

3、吸取200μL上清液于微量石英比色皿或96孔板中，測定532nm和600nm處的吸光度，記為A532和A600，ΔA= A532-A600。

MDA含量計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）中MDA含量的計算：

MDA含量(nmol/ mL)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣=25.8×ΔA 

2、細菌、細胞或動物組織中MDA含量計算

（1）按照蛋白濃度計算

MDA含量(nmol/ mg prot)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣)=25.8× ΔA ÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按照樣品質(zhì)量計算

MDA含量(nmol/g 鮮重)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)=25.8×ΔA ÷W

 (3 ) 按照細菌或細胞密度計算：

MDA含量(nmol/104)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)=0.0516×ΔA

V反總：反應體系總體積， 4×10-4 L；ε：丙二醛摩爾消光系數(shù)，155×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）中MDA含量的計算：

MDA含量(nmol/ mL)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣=51.6×ΔA 

2、細菌、細胞或動物組織中MDA含量計算

（1）按照蛋白濃度計算

MDA含量(nmol/ mg prot)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣)=51.6×ΔA÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按照樣品質(zhì)量計算

MDA含量(nmol/g 鮮重)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)=51.6×ΔA÷W

 (3 ) 按照細菌或細胞密度計算：

MDA含量(nmol/104)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)=0.1032×ΔA

V反總：反應體系總體積，4×10-4 L；ε：丙二醛摩爾消光系數(shù)，155×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。

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