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注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義

二氫黃酮醇還原酶是類黃酮合成途徑中的一個關鍵酶，在決定植物的花色、葉色、果色和其他經(jīng)濟器官的色澤及其營養(yǎng)品質(zhì)方面起著重要作用。

測定原理

二氫黃酮醇還原酶作用于二氫槲皮素產(chǎn)生兒茶素，可與縮合形成紅色化合物，在500nm處有特征吸收峰。

需自備的儀器和用品

研缽、低溫離心機、震蕩儀、氮吹儀、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、水浴鍋、無水乙醇、乙酸乙酯。

試劑組成和配制

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體12mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體1.5mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加2mL蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑四：液體30mL×1瓶，4℃避光保存。

酶液提取

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定操作表

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調(diào)節(jié)波長至500nm。

2. 操作表

酶活性計算公式

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y=0.0184x+0.0002，R2=0.999

（1）按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在30℃，pH7.5條件下，每毫克蛋白每分鐘分解二氫槲皮素產(chǎn)生1mmol兒茶素所需的酶量為一個酶活力單位。

DFR活性（mmol/min/mg prot）=（△A-0.0002）÷0.0184×V反總÷（V樣×Cpr）÷T÷2

= 9.06×（△A-0.0002）÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：在30℃，pH7.5條件下，每克組織每分鐘分解二氫槲皮素產(chǎn)生1mmol兒茶素所需的酶量為一個酶活力單位。

DFR活性（mmol/min/g 鮮重）= （△A-0.0002）÷0.0184×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T÷2

= 9.06×（△A-0.0002）÷W

V反總：反應總體積，1mL；V樣：反應體系中樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應時間，30min

b．用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y=0.0092x+0.0002，R2=0.999

（1）按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在30℃，pH7.5條件下，每毫克蛋白每分鐘分解二氫槲皮素產(chǎn)生1mmol兒茶素所需的酶量為一個酶活力單位。

DFR活性（mmol/min/mg prot）=（△A-0.0002）÷0.0092×V反總÷（V樣×Cpr）÷T÷2

= 9.06×（△A-0.0002）÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：在30℃，pH7.5條件下，每克組織每分鐘分解二氫槲皮素產(chǎn)生1mmol兒茶素所需的酶量為一個酶活力單位。

DFR活性（mmol/min/g 鮮重）= （△A-0.0002）÷0.0092×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T÷2

= 9.06×（△A-0.0002）÷W

V反總：反應總體積，1mL；V樣：反應體系中樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應時間，30min

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