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正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

 SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成H2O2和O2。SOD不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。

測定原理：

通過嘌呤及嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O2-.)，O2-.可還原氮藍(lán)四唑生成藍(lán)色甲臜，后者在560nm處有吸收；SOD可清除O2-.，從而抑制了甲臜的形成；反應(yīng)液藍(lán)色越深，說明SOD活性愈低，反之活性越高。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀、離心機、移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體5mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體200μL×1支，4℃保存；

試劑三：液體4mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×2瓶，4℃保存。

粗酶液提取： 

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500  萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至560nm。

2. 將試劑二用蒸餾水稀釋兩倍，用多少配多少。（試劑二和蒸餾水1：1稀釋）

3. 將一瓶試劑四用5mL蒸餾水溶解（溶解后一周內(nèi)用完），再用蒸餾水稀釋4倍，用多少配多少（試劑四和蒸餾水1：3稀釋）。

4. 測定前將試劑一、三和四在37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）水浴5min以上。

5. 樣本測定（在EP管或96孔板中依次加入下列試劑）

充分混勻，室溫靜置30min后，560nm處測定各管吸光值A(chǔ)。

注意事項：

1、試劑二為酶，不可冷凍，使用時在冰上放置。

2、對照管只需要做一管。

3、若對照管吸光值大于1，建議將試劑二用蒸餾水稀釋7倍后使用（10μL試劑二原液+60μL蒸餾水）。

4、SOD為什么有的樣本測定管大于對照管，對照管數(shù)值在什么范圍？

對照管的范圍是0.4-1。對照管吸光值過低可能是（1）試劑二或試劑四沒有現(xiàn)配現(xiàn)用；（2)沒有按順序加試劑；（3）反應(yīng)時間不夠，可以延長反應(yīng)時間（反應(yīng)時間30min可以延長到40min）。對照管吸光值過高可能是試劑二未按操作說明書稀釋相應(yīng)倍數(shù)。

若出現(xiàn)測定管大于對照管，可能是樣本中雜質(zhì)的影響太大，為了降低雜質(zhì)的影響一般將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋10倍后再測，通?？梢允箿y定正常。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

SOD活性計算：

1、抑制百分率的計算

抑制百分率＝(A對照管－A測定管) ÷A對照管× 100%

盡量使樣本的抑制百分率在10-90%范圍內(nèi)。如果計算出來的抑制百分率小于10%或大于90%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需將樣本用提取液適當(dāng)稀釋；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測樣本。

2、SOD酶活性單位：在上述嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位(U/mL)。 

3、SOD酶活性計算：

（1）血清（漿）SOD活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V反總]÷V樣

=11.11×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

（2）組織、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞SOD活力計算：

a.按樣本蛋白濃度計算

SOD活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V反總]÷(V樣×Cpr)

 =11.11×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷Cpr 

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

b.按樣本鮮重計算

SOD活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V反總]÷(W ×V樣÷V樣總)

 =11.11×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷W

c.按細(xì)菌或細(xì)胞個數(shù)計算

SOD活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率) ×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)

 =0.022×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

 V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.018mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL ；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。

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