產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 |
HRbio™ Ⅲ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit HRbio™ Ⅲ miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加尾法） | HRF0701 | 25 T |
產(chǎn)品描述
本產(chǎn)品miRNA鏈合成試劑盒采用Poly(A)加尾法原理，首先在miRNA 3’末端加Poly(A)尾，再使用 Anchored oligo(dT)-universal tag 通用逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成 miRNA 對應(yīng)的鏈cDNA。本產(chǎn)品使用特殊優(yōu)化預(yù)混合 miRNA RT Enzyme Mix 將 Poly(A)加尾和逆轉(zhuǎn)錄合并為一步完成，大大簡化了操作步驟并提高 Poly(A)加尾和逆轉(zhuǎn)錄效率， 本產(chǎn)品可從20pg-2μg 的 Total RNA 中有效制備 miRNA 對應(yīng)的鏈cDNA。
產(chǎn)品用途
用于miRNA對應(yīng)cDNA鏈的合成。本產(chǎn)品可從20pg-2μg 的 Total RNA 中有效制備 miRNA的cDNA。
本產(chǎn)品需與HRbio™ miRNA qPCR Kit miRNA熒光定量PCR試劑盒配套使用。
產(chǎn)品組分
編號 | 組分 | HRF0701（25T） |
HRF070-A | miRNA RT Enzyme Mix | 50 μL |
HRF070-B | 2×miRT Reaction Mix | 250 μL |
HRF070-C | RNase free H2O | 1 mL |
運輸和保存方法
干冰運輸。-20℃保存，避免反復(fù)凍融，有效期1年。
使用方法
miRNA 3’末端進行Poly (A)加尾和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（鏈合成）
1.解凍2×miRNA RT Reaction Mix并混勻，miRT Enzyme Mix放于冰中備用，加入以下試劑至總體積20μl(注意：最后加入miRNA RT Enzyme Mix)
| 組分 | 體積 | 終濃度 |
Total RNA （見注意事項） | x μL | Up to 2μg |
2 ×miRNA RT Reaction Mix | 10 μL | 1× |
miRNA RT Enzyme Mix | 2 μL（見注意事項） | - |
加RNase free H2O補足到 | 20 μL | - |
2.移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心后在42°C反應(yīng)60 min。
3.85°C加熱5秒鐘失活miRNA RT Enzyme Mix。
4.合成的cDNA反應(yīng)液可放置于-20°C保存；也可以直接進行下游PCR或者熒光定量PCR檢測。
miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加尾法）
注意事項
1）miRNA RT Enzyme Mix比較粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導(dǎo)致?lián)p失，用前請點甩離心，并且避免吸頭外壁沾附損失。Enzyme Mix內(nèi)酶都是過量的，即使每次按照 1.8μl使用，也不影響使用效果。
2）在反應(yīng)中使用的total RNA 必須包含有小分子RNA(miRNA)。此過程也可以使用富集的miRNA， 單純miRNA無法直接用分光光度計定量，建議直接加入2μl ~5μl。可根據(jù)目的miRNA豐度決定加入量，但是對于低豐度miRNA 樣品而言(如血清血漿提取物)，可直接加入體積8 μl。
3）按照上述操作步驟得到的cDNA模板用于下游PCR或者熒光定量PCR檢測時，可以根據(jù)實際情況選擇使用量，對于特殊的檢測體系中，高含量的cDNA 模板易導(dǎo)致非特異性擴增，可根據(jù)所檢測miRNA 的豐度適當?shù)南♂宑DNA（5-10倍或者100倍）后使用。如果發(fā)現(xiàn)有非特異擴增條帶，或者溶解曲線顯示有非特異擴增，往往提示cDNA模板過量， 可以嘗試將上述cDNA模板稀釋幾十到幾百倍甚至上千倍再使用。
4）本產(chǎn)品僅作科研用途！
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