產(chǎn)品信息
| 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 |
| HRbio™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(with gDNA Removal),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（包含基因組DNA清除劑） | HRF0462 | 100 T |
產(chǎn)品描述
本產(chǎn)品是一種高效、穩(wěn)定、快速并可以去除基因組 DNA 污染的反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。試劑盒采用新一代反轉(zhuǎn)錄酶，大大提高了穩(wěn)定性和反轉(zhuǎn)錄效率。本試劑盒為一管式反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液，5×RT Master Mix 中含有反轉(zhuǎn)錄鏈合所需的所有試劑（RTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、Buffer）。通常Real Time RT-PCR等實(shí)驗(yàn)需要先用 DNase I 消化去除RNA中殘留的基因組DNA(gDNA) ，但是傳統(tǒng)DNase I處理復(fù)雜并容易造成RNA的降解和損失。本試劑盒中使用了具有DNA分解活性的4×gDNA Removal 可2分鐘消除gDNA殘留，不需要DNase消化和后續(xù)繁瑣步驟。
適用范圍
鏈cDNA合成?？捎糜诟呖截悺⒌涂截惢虻臋z測(cè)。
產(chǎn)品組成
| 組成 | 100 T |
| 4×gDNA Removal | 400 μl |
| 5×RT Master Mix | 400 μl |
| 5×RT Control Mix* | 40 μl |
| RNase free H2O | 1 ml |
*5×RT Control Mix 和5×RT Master Mix 成分一致，只是不含RTase 反
轉(zhuǎn)錄酶，可以用于反轉(zhuǎn)錄的陰性對(duì)照。
運(yùn)輸和保存方法
－20℃ 保存，有效期 12 個(gè)月。
產(chǎn)品特點(diǎn)
1、新一代反轉(zhuǎn)錄酶大幅度提高了穩(wěn)定性和反轉(zhuǎn)錄效率。
2、采用gDNA Removal僅需2分鐘清除DNA殘留，不需要DNase 消化和后續(xù)繁瑣步驟。
3、全預(yù)混的反轉(zhuǎn)錄Mix，只需加入RNA和水，15分鐘簡(jiǎn)單快速完成反轉(zhuǎn)錄。
4、同時(shí)2種Mix在-20℃不易凍結(jié)，減少了化凍和混勻時(shí)間，使用更簡(jiǎn)單。
5、本產(chǎn)品針對(duì)qPCR進(jìn)行特別優(yōu)化oligo dT和N6隨機(jī)引物配比，使cDNA合成可從RNA轉(zhuǎn)錄本的各個(gè)區(qū)域起始并具有相同的反轉(zhuǎn)錄效率，保證了qPCR結(jié)果的真實(shí)性和可重復(fù)性。
操作步驟
(以20 μl反應(yīng)體系為例，也可以采用10μl反應(yīng)體系)
1、將模板RNA和5×RT Master Mix在冰上解凍；4×gDNA Removal 和RNase free H2O 在室溫（15-25℃）解凍，解凍后迅速置于冰上。使用前將每種溶液輕彈或者輕微渦旋振蕩混勻，可簡(jiǎn)短離心以收集殘留在管壁的液體到管底。
2、在RNAse free管里面加入以下成分：(建議使用PCR管冰上配制)
| 組成 | 體積 |
| Total RNA/mRNA | ≤ 12 μl * |
| 4×gDNA Removal | 4 μl (見注意事項(xiàng) 3) |
| RNase free H2O | to 16 μl（補(bǔ)足到總體積 16 μl） |
*Total RNA 建議不超過 2 μg，mRNA 不超過 200 ng (20μl 體系)
3、移液器輕輕吹打混勻，42℃孵育2分鐘（或者37℃孵育5分鐘）。控溫步驟均建議PCR儀器上進(jìn)行。
4、繼續(xù)直接在同一管加入如下成份：
| 組成 | 體積 |
| 5×RT Master Mix | 4 μl (見注意事項(xiàng) 3) |
5、移液器輕輕吹打混勻（總體積20 μl）
如使用mRNA模板是來源于真核細(xì)胞（如人、小鼠的組織細(xì)胞）含有Poly(A)尾結(jié)構(gòu)，42℃孵育15-20min。
如使用mRNA模板是來源于原核細(xì)胞（細(xì)菌）或者病毒等不含Poly(A)尾結(jié)構(gòu)，25℃孵育10 min，42℃孵育15-20min。
注意：如果模板具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或高GC區(qū)域，可嘗試將反應(yīng)溫度提高至50℃，有助于提高產(chǎn)量。
6、85℃加熱 5 sec 失活RTase和gDNA Removal。
7、得到的cDNA產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng)，或在-20℃保存，并在半年內(nèi)使用；長期存放建議分裝后在-70℃保存。cDNA應(yīng)避免反復(fù)凍融。
RT-qPCR
取適量反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物（一般不超過qPCR反應(yīng)體積的1/10）作為qPCR模板，按照廠家熒光定量PCR試劑說明書進(jìn)行下一步熒光定量PCR。 如果表達(dá)基因含量豐富，可以根據(jù)實(shí)際適當(dāng)稀釋cDNA模板使用。
逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（包含基因組DNA清除劑）
注意事項(xiàng):
1、避免RNase污染。
2、為保證反轉(zhuǎn)錄成功建議使用高質(zhì)量的RNA樣品。
3、4×gDNA Removal 、5×RT Master Mix 非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導(dǎo)致?lián)p失，用前請(qǐng)點(diǎn)甩離心后使用，并且避免吸頭外壁沾附損失。4×gDNA Removal和5×RT Master Mix內(nèi)包含的酶均為過量，即使每次按照3.6 μl-3.8 μl使用，也不影響使用效果。
4、可以不經(jīng)過基因組去除步驟，直接用5 ×RT Master Mix 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，這樣所得到的結(jié)果會(huì)與使用RT Master Mix相當(dāng)。
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