非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)試劑盒（恒溫?zé)晒夥ǎ?/font>使用說明書

【產(chǎn)品說明】

本產(chǎn)品基于的恒溫?zé)晒鈾z測(cè)技術(shù)，可針對(duì)抗凝血、脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)、腎臟和骨髓等樣品中非洲豬瘟病毒的的特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過程中的熒光信號(hào)變化，自動(dòng)判讀結(jié)果。

本產(chǎn)品用于非洲豬瘟病毒的檢測(cè)，檢出限為10² copies/μl。

【貨 號(hào)】 YRMBV7201-2

【包裝規(guī)格】 50T

【試劑盒組成】

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃保存，有效期為12個(gè)月（請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)使用）。

【適用儀器】

YR-820 恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀。

【樣品采集及存放】

待測(cè)樣品為 -20℃保存樣本或新鮮待檢樣本

【樣品處理】

可采集發(fā)病動(dòng)物或同群動(dòng)物的血清學(xué)樣品和病原學(xué)樣品，病原學(xué)樣品主要包括抗凝血、脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)、腎臟和骨髓等。如環(huán)境中存在鈍緣軟蜱，也應(yīng)一并采集。

樣品的包裝和運(yùn)輸應(yīng)符合《高致病性動(dòng)物病原微生物菌（毒）種或者樣本運(yùn)輸包裝規(guī)范》規(guī)定。規(guī)范填寫采樣登記表，采集的樣品應(yīng)在冷藏和密封狀態(tài)下運(yùn)輸?shù)较嚓P(guān)實(shí)驗(yàn)室。

一、血清學(xué)樣品：無菌采集5ml血液樣品，室溫放置12～24h，收集血清，冷藏運(yùn)輸。到達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室后，冷凍保存。

二、病原學(xué)樣品

1．抗凝血樣品：無菌采集5ml抗凝血，冷藏運(yùn)輸。到達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室后，－70℃冷凍保存。

2．組織樣品

2.1 脾臟，其次為扁桃體、淋巴結(jié)、腎臟、骨髓等，冷藏運(yùn)輸。

2.2 樣品到達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室后，－70℃保存。

3．鈍緣軟蜱

3.1 將收集的鈍緣軟蜱放入有螺旋蓋的樣品瓶/管中，放入少量土壤，蓋內(nèi)襯以紗布，常溫保存運(yùn)輸。

3.2 到達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室后，－70℃冷凍保存或置于液氮中；如僅對(duì)樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察時(shí)，可以放入99%酒精中保存。

【檢測(cè)步驟】

自備材料和儀器：①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②滅菌0.2mL PCR管或八聯(lián)管；③冰盒；④移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；⑤離心機(jī)；⑥渦旋混勻器；⑦金屬浴

一、DNA提取（樣本制備區(qū)）

建議使用病毒基因組DNA提取試劑盒系列產(chǎn)品，具體過程詳見說明書。

二、試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）

若有N個(gè)待檢樣品，則參照下表，按照N+2個(gè)數(shù)量計(jì)算各組分用量（N個(gè)待檢樣品+1個(gè)陰性對(duì)照NG+1個(gè)陽性對(duì)照PG），將反應(yīng)液置于0.6ml或者1.5ml離心管中，渦旋混勻，離心30秒，分裝于0.2ml PCR管中，并向每管加入1滴C-I（約20μl）。

三、添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）

向PCR管中分別加入2μl模板，順序?yàn)?/font>陰性對(duì)照（陰性對(duì)照管可不加入模板）、待測(cè)樣品模板、PG-ASFV-I，離心30秒，立即進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

四、擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

(一)、恒溫儀器63℃條件下反應(yīng)30 min。待儀器升溫至63℃后，新建程序，設(shè)置實(shí)驗(yàn)名稱及反應(yīng)時(shí)間，將步驟三中離心后的PCR反應(yīng)管放入恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀，點(diǎn)擊開始檢測(cè)。

(二)、若使用熒光定量PCR儀，則熒光基團(tuán)選擇FAM，淬滅基團(tuán)選擇None，將63℃ 15 s，63℃ 45 s作為一個(gè)循環(huán)，于63℃ 45 s處收集熒光信號(hào)，30個(gè)循環(huán)。

其他儀器請(qǐng)參照儀器說明書進(jìn)行設(shè)置。

【結(jié)果判定】

1、 儀器自動(dòng)判定結(jié)果，若顯示“陽性”，則樣品中含有非洲豬瘟病毒；

若顯示“陰性”，則樣品中不含有非洲豬瘟病毒或含量低于檢測(cè)限。

2、 在檢測(cè)儀上，根據(jù)有無“S”型擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。

若有“S”型擴(kuò)增曲線，則樣品中含有非洲豬瘟病毒；

若無“S”型擴(kuò)增曲線，則樣品中不含有非洲豬瘟病毒或含量低于檢測(cè)限。

« 陰性對(duì)照反應(yīng)管結(jié)果顯示“陰性”，陽性對(duì)照反應(yīng)管結(jié)果顯示“陽性”，此次檢測(cè)結(jié)果有效，否則無效。如重復(fù)檢測(cè)結(jié)果仍為無效，請(qǐng)與技術(shù)支持人員聯(lián)系。

【注意事項(xiàng)】

1、本試劑檢測(cè)靈敏度高。為了防止污染，實(shí)驗(yàn)要分區(qū)操作。

1）一區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)；2）第二區(qū)：樣本制備區(qū)；第三區(qū)：模板添加區(qū)；第四區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。

★ 分區(qū)之間*進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2、實(shí)驗(yàn)過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨(dú)立使用工具，需更換手套和實(shí)驗(yàn)服。

3、嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請(qǐng)嚴(yán)格按照說明書要求在冰盒上操作。

4、反應(yīng)液中的成分對(duì)光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測(cè)頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。

5、反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增管請(qǐng)置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6、不同批號(hào)試劑請(qǐng)勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。

原創(chuàng)作者：廈門科朋儀器有限公司