復(fù)雜基質(zhì)中的未知物注釋，常?？ㄔ趦蓚€問題上：1. 沒有觸發(fā)到潛在目標物的MS2信息；2. 即使采集到了 MS2 也未必足以定位結(jié)構(gòu)差異。賽默飛 Orbitrap Tribrid “三合一”超高分辨質(zhì)譜平臺，通過其智能數(shù)據(jù)采集、多級碎裂、實時譜庫搜索及多種碎裂方式，大大提升了未知物發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)注釋的效率和置信度。
全新一代 Orbitrap Tribrid “三合一”超高分辨質(zhì)譜平臺硬件結(jié)構(gòu)圖(點擊查看大圖)
未知物注釋，難點從來不只是“有沒有峰”
在藥物研發(fā)、代謝組學(xué)、食品與天然產(chǎn)物研究中，LC-MS 往往可以從復(fù)雜樣本中發(fā)現(xiàn)大量特征峰。
但真正困難的是：這個峰是不是樣本相關(guān)？它和母體化合物或某一類化合物有什么結(jié)構(gòu)關(guān)系？MS2 信息夠不夠判斷修飾位置、糖基連接方式或代謝位點？如果需要 MS3、MS4 甚至正交碎裂信息，儀器方法又能否在有限的色譜峰寬內(nèi)把關(guān)鍵數(shù)據(jù)采集到？
這正是 Orbitrap Tribrid 平臺在未知物解析中發(fā)揮價值的地方。通過四極桿、線性離子阱與 Orbitrap 高分辨質(zhì)量分析器的組合，既能獲得高分辨精確質(zhì)量信息，也能在同一套 LC-MS 方法中靈活采集 MSn 結(jié)構(gòu)信息。
藥物代謝物鑒定，先把采集目標對準“真正相關(guān)”的離子
藥物代謝物鑒定 MetID 的目標不只是找到代謝物，還要盡可能判斷代謝修飾發(fā)生在什么位置。復(fù)雜生物基質(zhì)中，背景離子、基質(zhì)成分和低豐度代謝物同時存在。如果采用常規(guī)數(shù)據(jù)依賴采集，儀器時間可能被高豐度背景離子占用，真正需要碎裂的低豐度代謝物反而錯過。
基于 Orbitrap Tribrid 質(zhì)譜儀的藥物代謝物鑒定工作流程示意圖(點擊查看大圖)
AcquireX 背景排除
AcquireX 背景排除策略，先通過空白基質(zhì)建立背景離子列表，記錄 m/z、保留時間和峰強度等信息。后續(xù)分析含藥物孵育樣本時，方法會優(yōu)先把 MS2/MSn 采集資源投向樣本中新出現(xiàn)的特征，也就是更可能與藥物及其代謝物相關(guān)的離子。
在 nefazodone 氧化代謝物示例中，AcquireX 背景排除幫助低豐度代謝物獲得碎裂數(shù)據(jù)，而不是讓采集資源繼續(xù)消耗在更強的背景信號上。相比傳統(tǒng)采集方式，該類智能采集策略可通過增加藥物相關(guān)代謝物的 MS2 觸發(fā)，提高約 30-50% 的代謝物鑒定表現(xiàn)。
圖示比較了保留時間 7.08 min 的奈法唑酮氧化代謝物(nefazodone + [O])前體離子在未啟用和啟用 AcquireX 背景排除工作流程時的 MS/MS 采集結(jié)果。結(jié)果表明，自動生成的排除列表可有效避免對高豐度基質(zhì)組分和背景離子的重復(fù)碎裂，將碎裂事件優(yōu)先分配給低豐度奈法唑酮代謝物，從而提高代謝物鑒定效率(點擊查看大圖)
對于很多代謝物，僅有 MS2 譜圖仍然不夠。
以 nefazodone 氧化代謝物為例，MS2 中的主要碎片可能對應(yīng)多個氧化位置，因此難以僅憑 MS2 判斷修飾位點。借助 Orbitrap Tribrid 的多級碎裂能力，進一步觸發(fā) MS3 后，文獻中通過更具結(jié)構(gòu)指向性的碎片離子，將氧化定位到 ethyl sidechain。
這類深度結(jié)構(gòu)信息并不適合對所有離子盲目采集，否則會拉長循環(huán)時間、降低整體覆蓋度。Met-IQ 工作流利用實時譜庫搜索 RTLS，把實驗 MS2 譜與母體化合物譜庫進行相似性匹配。只有當(dāng)未知物與母體藥物呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)相關(guān)性時，才觸發(fā) MS3 或其他后續(xù)掃描。
在 losartan 人肝微粒體孵育樣本中，該策略讓獲得 MS3 數(shù)據(jù)的 losartan 相關(guān)代謝物數(shù)量從傳統(tǒng) ddMS3 實驗的 10 個增加到 24 個。換句話說，儀器把更深層的碎裂時間花在了更值得解析的目標上。
對氧化奈法唑酮代謝物 MS³ 碎裂譜中的碎片離子進行歸屬分析，成功將氧化生物轉(zhuǎn)化位點定位于乙基側(cè)鏈
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在 Met-IQ 工作流程中，當(dāng) m/z 615 代謝物的 MS/MS 碎裂譜與氯沙坦母體化合物譜庫表現(xiàn)出相似性匹配時，系統(tǒng)會自動觸發(fā)選擇性 MS³ 數(shù)據(jù)采集，從而獲取更豐富的結(jié)構(gòu)信息
(點擊查看大圖)
正交碎裂：當(dāng) HCD/CID 看不清時，UVPD 提供另一種結(jié)構(gòu)視角
代謝物結(jié)構(gòu)解析中，經(jīng)常會遇到“碎了，但碎得不夠有信息量”的情況。尤其是葡萄糖醛酸化、GSH 結(jié)合等較易斷裂的修飾，HCD 或 CID 可能優(yōu)先斷開不穩(wěn)定鍵，導(dǎo)致譜圖中缺少能定位連接位置的關(guān)鍵碎片。
文中展示了 UVPD 紫外光解離在這類問題上的價值。以 diclofenac 酰基葡萄糖醛酸化代謝物為例，HCD 譜圖難以確認葡萄糖醛酸連接位置，而 UVPD 產(chǎn)生的特征碎片可以支持?；咸烟侨┧徭I的判斷。對于兩個氧化加葡萄糖醛酸化的同分異構(gòu)代謝物，UVPD 譜圖中含葡萄糖醛酸的特征碎片差異，也幫助區(qū)分氧化位點并確認連接信息。
這說明在復(fù)雜 MetID 任務(wù)中，多種碎裂方式并不是簡單疊加，而是在不同結(jié)構(gòu)難題上形成互補。
普萘洛爾葡萄糖醛酸結(jié)合物分別采用 HCD、CID 和 UVPD 進行碎裂分析得到的質(zhì)譜圖。圖中重點標出了 UVPD 特有的、具有重要結(jié)構(gòu)解析價值的碎片離子(點擊查看大圖)
雙氯芬酸(上)及其葡萄糖醛酸代謝物(中)的 HCD 碎裂譜比較顯示，HCD 未能產(chǎn)生足以確認葡萄糖醛酸結(jié)合位點的診斷性碎片離子。相比之下，UVPD 碎裂譜(下)基于 m/z 327 特征離子的碎片結(jié)構(gòu)歸屬，成功確定了?；咸烟侨┧徭I(acyl-glucuronide bond)的結(jié)構(gòu)特征(點擊查看大圖)
比較了雙氯芬酸兩種氧化-葡萄糖醛酸化異構(gòu)代謝物(M+[O]+[GlcA])的 HCD 和 UVPD 碎裂譜。通過對圖中重點標示的 UVPD 特征碎片離子進行結(jié)構(gòu)歸屬，不僅能夠區(qū)分兩種異構(gòu)體的氧化位點，還可確認其發(fā)生的是?；咸烟侨┧峄?acyl glucuronidation)(點擊查看大圖)
對于復(fù)雜樣本中的未知物，精確質(zhì)量數(shù)是起點，結(jié)構(gòu)置信度才是終點。
從藥物代謝物鑒定到化合物高通量注釋，當(dāng)高分辨檢測、多級碎裂能力、智能采集策略、實時譜庫搜索和結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件結(jié)合在一起，未知物解析可以從“發(fā)現(xiàn)更多峰”進一步走向“獲得更可信的結(jié)構(gòu)答案”。
對于關(guān)注 MetID、天然產(chǎn)物、食品組學(xué)、植物代謝組學(xué)及復(fù)雜樣本非靶向分析的實驗室而言，這類 Orbitrap Tribrid 工作流提供了一條值得參考的路徑：在同一次 LC-MS 分析中，盡可能采到更相關(guān)、更深入、更可解釋的結(jié)構(gòu)信息！
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