未知代謝物離子來源、身份與結(jié)構(gòu)的可靠注釋，一直是質(zhì)譜代謝組領(lǐng)域長(zhǎng)期存在的技術(shù)難題。質(zhì)譜學(xué)界提出“代謝暗物質(zhì)”(metabolic dark matter)或“暗代謝組”(dark metabolomics)的概念，指代那些現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫難以注釋與鑒定的未知小分子物質(zhì)，這些物質(zhì)既有來源于生物樣本但無法確證的真實(shí)代謝物，也有電離過程引入的次生離子（即假陽性代謝物或偽代謝物）。
相較于電子轟擊離子化(Electron Impact, EI)，電噴霧離子化(Electrospray Ionization, ESI)一直被認(rèn)為是一種極軟的電離方式，除目標(biāo)分子離子以外，僅存在少量源內(nèi)裂解碎片離子，以及來源于溶劑、管路、器皿等雜質(zhì)與背景離子。隨著質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度、質(zhì)量分辨率與采集效率的提升，電噴霧微液滴的自由基氧化還原、惰性鍵活化、能壘降低與反應(yīng)加速等氣液界面理化特性，被逐漸認(rèn)識(shí)。ESI過程中的微液滴階段會(huì)引發(fā)遠(yuǎn)超預(yù)期的暗化學(xué)反應(yīng)，生成許多現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫無法注釋的離子，這即對(duì)離子來源的準(zhǔn)確識(shí)別造成嚴(yán)重干擾，也增加了真實(shí)未知代謝物離子的注釋難度。
近日，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所再帕爾·阿不力孜教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合斯坦福大學(xué)Richard N. Zare教授團(tuán)隊(duì)，在《ACS Measurement Science Au》發(fā)表研究論文，首次系統(tǒng)揭示ESI過程產(chǎn)生的微米級(jí)液滴氣-液界面，會(huì)引發(fā)代謝物之間發(fā)生次生反應(yīng)，生成大量低豐度的偽代謝物離子和假陽性代謝物離子。團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)解析了微液滴六個(gè)典型的暗反應(yīng)路徑，開發(fā)了次生離子的預(yù)測(cè)與自動(dòng)識(shí)別程序，構(gòu)建了新型氣流輔助噴霧電離裝置（Air Flow Assisted Spray Ionization, AFASI），從電離源頭減少偽代謝物和假陽性代謝物離子產(chǎn)生，搭配賽默飛 Orbitrap 高分辨質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)暗離子精準(zhǔn)識(shí)別與暗反應(yīng)的大幅抑制，顯著提升代謝物離子來源識(shí)別的準(zhǔn)確度和注釋可信度。
自動(dòng)注釋程序：大幅提升代謝物離子的準(zhǔn)確識(shí)別率
研究系統(tǒng)總結(jié)了ESI中可能發(fā)生的多種微液滴次生反應(yīng)(氧化還原、脫羧偶聯(lián)、自由基加成、還原胺化等)，甚至氮?dú)忪F化氣、甲醇、乙腈流動(dòng)相溶劑也會(huì)參與到亞硝基化、甲基化、乙?；磻?yīng)造成假陽性代謝修飾，容易被誤認(rèn)為是新的代謝物。以對(duì)氨基苯甲酸為例，相較于源內(nèi)碎裂(in-source CID)，電噴霧微液滴反應(yīng)進(jìn)度和次生離子強(qiáng)度，會(huì)隨著噴針到質(zhì)譜進(jìn)樣口的距離延長(zhǎng)而增強(qiáng)，表明很多"未知峰"是在液滴飛行過程中逐漸形成，而不僅是進(jìn)入質(zhì)譜以后通過裂解產(chǎn)生。
基于已知代謝物結(jié)構(gòu)和微液滴反應(yīng)規(guī)則，團(tuán)隊(duì)自建了次生反應(yīng)產(chǎn)物離子的預(yù)測(cè)算法，根據(jù)不同微液滴暗反應(yīng)生成的次生離子結(jié)構(gòu)和質(zhì)量偏移不同，實(shí)現(xiàn)了次生離子預(yù)測(cè)與自動(dòng)識(shí)別、注釋程序（已開源），其工作流程如下：輸入已標(biāo)注代謝物的名稱或SMILES結(jié)構(gòu)編碼信息→根據(jù)代謝物結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可能的微液滴次生反應(yīng)→計(jì)算理論產(chǎn)物分子量與離子精確質(zhì)荷比→與實(shí)測(cè)離子匹配→輸出注釋結(jié)果。
Orbitrap質(zhì)譜實(shí)測(cè)驗(yàn)證暗離子
為驗(yàn)證該程序，研究在正離子模式下使用ESI-MS檢測(cè)由70種已知代謝物組成的混合溶液，扣除常見背景離子和強(qiáng)度低于102的隨機(jī)噪音離子后，共檢出1744個(gè)離子，其中僅113個(gè)（5.3%）為真實(shí)代謝物的質(zhì)子/鈉加合峰，使用自動(dòng)注釋程序，成功識(shí)別了 978個(gè)次生離子，未知暗離子的注釋率提升至56%（按總離子強(qiáng)度計(jì)超91%）。依托賽默飛 Orbitrap 超高分辨、高質(zhì)量精度優(yōu)勢(shì)，可精準(zhǔn)區(qū)分真實(shí)代謝物與質(zhì)量偏差極小的偽代謝物離子，從而避免了未知代謝物離子的假發(fā)現(xiàn)率。該程序同樣適用于納升電噴霧(nESI)、解吸電噴霧(DESI)、紙噴霧(PSI)等多種涉及噴霧微液滴過程的電離技術(shù)。
圖1 幾種噴霧電離源的微液滴次生暗離子占比及其自動(dòng)識(shí)別與標(biāo)注情況(點(diǎn)擊查看大圖)
AFASI裝置：從源頭抑制次生暗離子產(chǎn)生
盡管自動(dòng)注釋程序提升了未知離子來源、身份的準(zhǔn)確識(shí)別與注釋，但是更理想的策略是從電離源頭直接抑制這些次生離子的產(chǎn)生。為此團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了氣流輔助噴霧電離(air-flow-assisted spray ionization, AFASI)裝置，其主要改進(jìn)在于將 ESI 電離源、質(zhì)譜儀進(jìn)樣口與真空泵相連形成一個(gè)密封腔室，采用更加惰性的氬氣替代氮?dú)庾鳛殪F化氣體，在傳輸管內(nèi)的真空梯度驅(qū)使下，噴霧微液滴可以瞬時(shí)蒸發(fā)電離，有效減少了其存在周期，以及代謝物在微液滴氣-液界面上的反應(yīng)時(shí)間。
實(shí)驗(yàn)表明，AFASI裝置可將次生離子強(qiáng)度降至1×102水平甚至更低，次生離子的總強(qiáng)度占比被壓低至10%以內(nèi)，同時(shí)仍能保持目標(biāo)代謝物的全面檢出。進(jìn)一步參數(shù)優(yōu)化表明，降低噴霧電壓、縮短微液滴存在周期、使用無水溶劑和惰性氣體氛圍，是減少次生離子產(chǎn)生的有效策略。AFASI裝置不僅可在無外加噴霧電壓下完成代謝物離子檢測(cè)，還支持遠(yuǎn)距離采樣，該裝置亦搭載于AFADESI-Orbitrap質(zhì)譜成像系統(tǒng)。
圖2 AFASI最大限度降低暗離子數(shù)量和強(qiáng)度水平，保證代謝組離子的生物來源真實(shí)性(點(diǎn)擊查看大圖)
AFASI-Orbitrap提升代謝組學(xué)暗物質(zhì)解析
AFADESI-Orbitrap系統(tǒng)搭載了本研究開發(fā)的AFASI電離裝置，能夠大幅減少假代謝物離子產(chǎn)生，同時(shí)支持質(zhì)譜成像功能，為空間代謝組學(xué)相關(guān)研究可提供更可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和更便捷的操作方案。對(duì)于代謝組學(xué)而言，理解電噴霧微液滴中的界面化學(xué)反應(yīng)，不僅有助于解釋長(zhǎng)期困擾的"暗代謝物"現(xiàn)象，也為保證未知離子來源與身份的準(zhǔn)確識(shí)別、離子注釋率的顯著提升、假陽性代謝物離子檢測(cè)結(jié)果、優(yōu)化液質(zhì)聯(lián)用實(shí)驗(yàn)方法提供了新的思路。
AFADESI可搭載賽默飛Orbitrap超高分辨質(zhì)譜全平臺(tái)
參考文獻(xiàn)：
Song, X.; Xu, J.; Sun, C.; Lyu, L.; Kui, H.; Zhang, R.; Abliz, Z.; Zare, R. N. Dark Reactions in Microdroplets Explain Widespread Artifacts in Metabolomic Profiling. ACS Meas. Sci. Au 2026, 6, 311–323.
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