生物大分子三維結(jié)構(gòu)解析是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的核心，傳統(tǒng)技術(shù)受限于表征難度、靈敏度等瓶頸。Thermo Scientific™ Orbitrap™ Ascend Editions三合一質(zhì)譜儀憑借多種碎裂/活化技術(shù)與可選配的Native MS 選項(xiàng)，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究提供強(qiáng)力支撐。
多種碎裂/活化技術(shù)，
精準(zhǔn)解構(gòu)分子細(xì)節(jié)
Orbitrap Ascend Editions 質(zhì)譜儀集成六種正交碎裂方式(CID、HCD、ETD、EThcD、ETciD、UVPD)和PTCR活化方式，且不同碎裂/活化方式之間可靈活組合，實(shí)現(xiàn)從肽段到完整蛋白的多方位結(jié)構(gòu)解析。
Orbitrap Ascend Editions 中的多種碎裂/活化方式
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1. 經(jīng)典碎裂技術(shù)：高效獲取基礎(chǔ)信息
CID，HCD 適用于常規(guī)肽段序列解析，其中HCD碎裂獲取更豐富信息，精準(zhǔn)定位N糖基化、磷酸化等翻譯后修飾(PTM)位點(diǎn)。
2. 電子轉(zhuǎn)移碎裂技術(shù)：適配復(fù)雜修飾場(chǎng)景
ETD可保留糖鏈等修飾信息，適用于O糖基化等特定修飾分析；可一定程度打開二硫鍵，結(jié)合三級(jí)分析可定位復(fù)雜二硫鍵位點(diǎn)；可特異性區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸，提高從頭測(cè)序分析的精準(zhǔn)性；可降低氫氘重排，在HDX分析中提高蛋白蛋白結(jié)合位點(diǎn)的分析精度；相比經(jīng)典碎裂技術(shù)，更適合完整蛋白Top-down或者M(jìn)iddle-down分析，獲得更高的序列覆蓋度。此外，衍生的EThcD、ETciD可進(jìn)一步提高ETD譜圖的質(zhì)量。
3. 紫外光解離技術(shù)：突破傳統(tǒng)碎裂局限
UVPD可斷裂更多類型化學(xué)鍵，獲得豐富的各類碎片離子，在Top-down分析中可作為正交碎裂方式使用。
4. PTCR技術(shù)：簡(jiǎn)化復(fù)雜譜圖
PTCR可在一級(jí)或多級(jí)后插入，通過(guò)質(zhì)子轉(zhuǎn)移，電荷減少，可有效簡(jiǎn)化復(fù)雜譜圖，提高一級(jí)解析成分的數(shù)目，提高二級(jí)或多級(jí)譜圖解析的覆蓋度。
5. 多種碎裂/活化協(xié)同：實(shí)現(xiàn)深度解析
上述多種不同的碎裂/活化方式可按需進(jìn)行搭配組合，例如HCDpdETD，HCDpdUVPD可用于未富集糖肽的解析；HCD，ETD，UVPD，PTCR組合可用于提高完整蛋白 Top-down和Middle-down的序列覆蓋度。此外，Orbitrap Ascend Editions質(zhì)譜儀溫和的離子源區(qū)設(shè)計(jì)，可保留不穩(wěn)定及低豐度修飾，以及其雙多極離子通道的設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)多流程同步，使其更適配于多種翻譯后修飾分析及 Top-down 蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
Native MS 選項(xiàng)，
還原天然結(jié)構(gòu)本貌
非變性質(zhì)譜是表征生物大分子天然構(gòu)象的核心技術(shù)，Orbitrap Ascend Editions質(zhì)譜儀可選的Native MS 選項(xiàng)，將Orbitrap檢測(cè)上限提至16,000 m/z，可高效檢測(cè)數(shù)百kDa級(jí)復(fù)合物(如800 kDa的GroEL蛋白)，也可用于膜蛋白分析。四極桿隔離范圍擴(kuò)展至8,000 m/z，在進(jìn)行大蛋白及復(fù)合物分析中，可選用四極桿替代離子阱進(jìn)行離子隔離。
Native MS 選項(xiàng)擴(kuò)展質(zhì)量范圍及隔離范圍
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應(yīng)用實(shí)例
01
結(jié)合 Native MS 與 DIA-PTCR解析膜蛋白結(jié)構(gòu)
膜蛋白積極參與細(xì)胞過(guò)程，大約占60% 的臨床藥物靶點(diǎn)，具有很高的研究?jī)r(jià)值。用于溶解膜蛋白的膜模擬物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，給非變性質(zhì)譜分析帶來(lái)困難。常見的膜模擬物包括去污劑膠束、納米盤(nanodiscs)和苯乙烯馬來(lái)酸脂質(zhì)顆粒(SMALPs)，可維持膜蛋白的原生結(jié)構(gòu)。
不同類型的膜模擬物
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對(duì)nanodisc中膜蛋白進(jìn)行 DIA-PTCR 分析(如分別針對(duì) m/z 7000、7300、7600 的 PTCR 掃描)，可分辨電荷價(jià)態(tài)，發(fā)現(xiàn)全掃描中隱藏的多個(gè)峰，提升分析準(zhǔn)確性。對(duì) DIA-PTCR 譜圖進(jìn)行滑動(dòng)窗口解卷積，得到 140-175 kDa 的分子量，相鄰解卷積峰間距為 700-750 Da，符合脂質(zhì)的分子量范圍，為 nanodisc中膜蛋白 - 脂質(zhì)復(fù)合物的組成分析提供依據(jù)[1]。
Nanodisc中膜蛋白的DIA-PTCR 譜圖及解卷積結(jié)果(點(diǎn)擊查看大圖)
02
結(jié)合多種碎裂/活化方式定位ADC藥物中的Payload
抗體藥物偶聯(lián)物(ADCs)通過(guò) linker 將單克隆抗體(mAb)與細(xì)胞毒性藥物(payload)共價(jià)結(jié)合，兼具抗體的靶向特異性和藥物的高殺傷活性，用于癌癥等疾病治療，但偶聯(lián)會(huì)導(dǎo)致 DAR 異質(zhì)性(藥物分子數(shù)量可變)和結(jié)合位點(diǎn)異質(zhì)性(偶聯(lián)位置不同)，影響產(chǎn)品安全性和療效。
傳統(tǒng)方法表征 payload結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，Bottom-up易產(chǎn)生人工修飾，無(wú)法反映天然狀態(tài)；Top-down序列覆蓋率低；Middle-down雖可分析～25 kDa 亞基，但 MS² 實(shí)驗(yàn)中碎片離子譜圖擁擠復(fù)雜，導(dǎo)致 payload 結(jié)合位點(diǎn)無(wú)法明確鑒定。結(jié)合多種碎裂/活化方式可有效定位ADC藥物中的payload [2]。
PTCR將原本集中在 800-1400 m/z 范圍的碎片離子分散至 500-8000 m/z 區(qū)間，降低碎片離子譜圖的復(fù)雜度，同時(shí)提升診斷離子的檢測(cè)率和鑒定可信度。
Fd′+1a 的EThcd MS2和 EThcD MS2-PTCR MS3譜圖對(duì)比(點(diǎn)擊查看大圖)
不同碎裂方式結(jié)合PTCR可分別有效提高序列覆蓋度。EThcD 與 PTCR 聯(lián)用表現(xiàn)最優(yōu)，F(xiàn)d′ 各亞基覆蓋率達(dá) 70.7%-72.0%，較不使用PTCR平均提升 17%。
不同碎裂方式結(jié)合PTCR前后的序列覆蓋度及payload位點(diǎn)(點(diǎn)擊查看大圖)
此外，兩種或多種碎裂/活化方式的結(jié)合，產(chǎn)生豐富的碎片形式，可明確亞基上的 payload 結(jié)合位點(diǎn)。
多種碎裂方式結(jié)合可明確payload的結(jié)合位點(diǎn)
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重構(gòu)結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析范式
Orbitrap Ascend Edition 質(zhì)譜儀以碎裂技術(shù)的靈活性與Native MS的天然構(gòu)象保留能力為核心，為基礎(chǔ)研究與藥物研發(fā)提供高效精準(zhǔn)支撐，成為推動(dòng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)突破的重要工具。
參考文獻(xiàn)：
[1] Establishing a Decision Tree for Native Mass Spectrometry Analysis of Membrane Proteins in Complex Membrane Mimetics. Thermo PO2023-21EN
[2] Enhanced Payload Localization in Antibody−Drug Conjugates Using a Middle-Down Mass Spectrometry Approach with Proton Transfer Charge Reduction. Anal. Chem. 2024, 96, 18483−18490
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