藥物臨床實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因包括靶點(diǎn)驗(yàn)證不足、療效缺乏以及脫靶導(dǎo)致的毒副作用等。因此，現(xiàn)代藥物開(kāi)發(fā)不僅要求生物活性分子能夠調(diào)節(jié)疾病表型，還應(yīng)明確其分子靶標(biāo)?；衔?、靶點(diǎn)和表型可視為臨床前藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程的三要素[1]。對(duì)于活性分子的未知作用靶點(diǎn)或潛在脫靶效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，通常需要通過(guò)高通量篩選的方法開(kāi)展。由于90%以上的藥物靶點(diǎn)為蛋白質(zhì)，因此基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)可在藥物靶點(diǎn)早期發(fā)現(xiàn)方面發(fā)揮重要作用。
圖1. 基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)在臨床前藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中的應(yīng)用[1](點(diǎn)擊查看大圖)
目前，利用蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的方法大致可以分為兩種：基于衍生化修飾的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和利用化合物結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物物理特性的影響進(jìn)行分析的方法。
基于衍生化修飾的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法需要首先對(duì)目標(biāo)化合物設(shè)計(jì)和連接某種探針?lè)肿覽2]，再根據(jù)探針特點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)將與化合物結(jié)合的蛋白進(jìn)行富集。該方法存在的問(wèn)題是前期開(kāi)發(fā)周期較長(zhǎng)，探針可能影響化合物活性構(gòu)象，有些化合物修飾難度較大。
圖2. 基于衍生化修飾的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[2](點(diǎn)擊查看大圖)
利用化合物結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物物理特性的影響進(jìn)行分析的方法無(wú)需對(duì)配體進(jìn)行化學(xué)修飾，包括LiP-MS (蛋白有限水解質(zhì)譜)、TPP (熱蛋白組分析)、SPROX (蛋白質(zhì)氧化速率穩(wěn)定性技術(shù))、TRAP (靶向響應(yīng)可及性)等。
其中，Lip-MS[3]的設(shè)計(jì)原理基于蛋白與配體結(jié)合后，暴露不同的廣譜蛋白酶酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生不同的蛋白酶切片段。中科院大連化物所葉明亮團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的PELSA[4]方法可同時(shí)高靈敏鑒定配體結(jié)合蛋白和結(jié)合位點(diǎn)，近期還入選了首屆“中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)十大進(jìn)展”。
圖3. Lip-MS技術(shù)[3](點(diǎn)擊查看大圖)
圖4. PELSA技術(shù)[4](點(diǎn)擊查看大圖)
TPP[5]的設(shè)計(jì)原理是利用蛋白隨溫度升高發(fā)生降解，當(dāng)結(jié)合藥物后，相同溫度下未降解蛋白的量會(huì)提高，該復(fù)合蛋白的熱熔曲線會(huì)右移。該方法還可用于活細(xì)胞水平的藥物靶點(diǎn)篩選。Gaetani[6]等在TPP的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)了PISA方法，將不同溫度處理的樣品混合后定量檢測(cè)，極大降低了樣本檢測(cè)數(shù)。每種藥物靶點(diǎn)篩選方法都有各自的優(yōu)勢(shì)和不足，需根據(jù)應(yīng)用場(chǎng)景選擇適合的一種或多種方法結(jié)合分析。
圖5. TPP技術(shù)[5](點(diǎn)擊查看大圖)
圖6. PISA技術(shù)[6](點(diǎn)擊查看大圖)
由于很多靶標(biāo)蛋白在體內(nèi)含量較低，且蛋白與配體結(jié)合后可檢測(cè)的變化差異往往也較小，這就需要后續(xù)的質(zhì)譜檢測(cè)方法提供盡可能高的蛋白檢測(cè)靈敏度和定量準(zhǔn)確性。以PISA為例，該方法雖然極大簡(jiǎn)化了TPP實(shí)驗(yàn)流程和樣本量，但由于將不同溫度點(diǎn)樣本合并，ΔSm反映出的定量差異往往更小。因此，以往檢測(cè)常采用TMT標(biāo)記后分多個(gè)餾分，再對(duì)每個(gè)餾分進(jìn)行長(zhǎng)梯度LC-MS分析。TMT標(biāo)記對(duì)于不熟悉蛋白組學(xué)樣品前處理的研究者來(lái)說(shuō)還是具有比較大的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)和AI算法的進(jìn)步，DIA采集和分析策略方面都取得了進(jìn)展。尤其是Orbitrap Astral質(zhì)譜儀，可實(shí)現(xiàn)2-Th窄窗口式數(shù)據(jù)非依賴性采集(nDIA)，在蛋白質(zhì)組鑒定深度、數(shù)據(jù)完整性、定量精度和通量方面都表現(xiàn)優(yōu)異。
我們以具有明確靶點(diǎn)的藥物甲氨蝶呤(MTX)為例進(jìn)行了Astral PISA-DIA測(cè)試，分別將DMSO或2mM MTX與人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1裂解液孵育，并在45-60℃范圍內(nèi)進(jìn)行6個(gè)不同溫度加熱處理，合并加熱后樣本，轉(zhuǎn)移上清進(jìn)行常規(guī)label free蛋白組學(xué)前處理，之后通過(guò)23分鐘梯度的Astral nDIA方法進(jìn)行檢測(cè)；各組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。本次測(cè)試使用DIA-NN軟件分析，共定量7380個(gè)蛋白組；以差異倍數(shù)(FC) 1.5、p<0.05閾值，共篩選出248個(gè)上調(diào)和368個(gè)下調(diào)蛋白；MTX的已知靶點(diǎn)DHFR顯著性變化在本次測(cè)試中也明確鑒定到。
與傳統(tǒng)PISA-TMT相比，Astral PISA-DIA顯著簡(jiǎn)化了樣本制備流程，并在極大縮短檢測(cè)時(shí)間的前提下可得到理想的鑒定結(jié)果。這也將使實(shí)際研究中進(jìn)行不同藥物濃度和加熱溫度等實(shí)驗(yàn)條件對(duì)比優(yōu)化更加便捷。
圖7. Orbitrap Astral PISA-DIA測(cè)試結(jié)果 (點(diǎn)擊查看大圖)
在蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)方面，Orbitrap Astral展示出*的檢測(cè)通量和覆蓋深度，已使開(kāi)展大規(guī)模的臨床樣本檢測(cè)、發(fā)現(xiàn)新的潛在生物學(xué)標(biāo)志物成為可能，助力疾病診斷更精準(zhǔn)。在藥物早期發(fā)現(xiàn)階段，結(jié)合多種靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)方法和Astral的優(yōu)異性能，也將更好的助力新化合物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、藥物新作用靶點(diǎn)篩選、脫靶風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等研究，進(jìn)而加速整體藥物研發(fā)進(jìn)程和降低后期臨床失敗風(fēng)險(xiǎn)。
圖8. Orbitrap Astral助力藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)研究(點(diǎn)擊查看大圖)
參考文獻(xiàn)：
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