其原理是：在PCR反應(yīng)體系中加入過量熒光染料，DNA擴(kuò)增的過程中，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈，發(fā)射熒光信號，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，并且可以實時測量。如果你要擴(kuò)增你的目標(biāo)樣品40個循環(huán)，在最后一個循環(huán)結(jié)束時檢測到的熒光會比在第10個循環(huán)測得的熒光強(qiáng)很多。

優(yōu)點：

1、成本較低，適合大規(guī)模的實驗。

2、在實驗設(shè)計階段非常省時，因為它只需要合適的引物設(shè)計。

缺點：

1、特異性不是很高。染料可以插入任何雙鏈DNA，包括引物二聚物和非特異性產(chǎn)物。

2、如果引物二聚體存在或者產(chǎn)物受到污染，得到的結(jié)果會不可靠。3、更容易與低豐度的目標(biāo)產(chǎn)生非特異性熒光。

需要更多的時間進(jìn)行結(jié)果分析。

這種方法涉及使用熒光標(biāo)記的寡核苷酸(短DNA分子)，探針通常在5 '端和3 '端都被標(biāo)記。

在探針的5’端有報告基團(tuán)，3’端設(shè)計淬滅基團(tuán)，當(dāng)報告基團(tuán)接近淬滅基團(tuán)時，不會檢測到熒光信號。RT-qPCR反應(yīng)時，寡核苷酸兩個基團(tuán)分離，即可檢測到熒光信號，并與PCR產(chǎn)物同步。

使用這種方法的熒光檢測依賴于兩個過程:1)引物與目標(biāo)序列的結(jié)合(2)探針與引物下游

互補序列的結(jié)合。

優(yōu)點：

1、更有可能只放大所需的產(chǎn)物，由于引物和探針的結(jié)合具有特異性。

2、不需要解離曲線，只有探針與正確的目的序列結(jié)合時才能檢測到熒光。

3、由于具有特異性，數(shù)據(jù)更可靠。

4、數(shù)據(jù)分析時節(jié)省時間。

缺點：

1、需要大規(guī)模實驗時耗費成本高。

2、需要更長的時間來設(shè)計實驗，因為需要好的引物和探針。