1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法）測蛋白濃度，是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白定量方法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，操作簡便，反應迅速且穩(wěn)定，靈敏度高，干擾因素少，因而得到廣泛的應用。其原理是：考馬斯亮蘭G-250染料在酸性溶液中與蛋白質結合，主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕紅色變?yōu)樗{色，形成的復合物顏色深淺在一定范圍內與蛋白質濃度成正比關系，因此可通過測定溶液在595nm處的光吸收度值來計算溶液中蛋白質的含量。

然而，即便是Bradford本人，也觀察到反應有一定程度的非線性，在蛋白濃度跨度變大時曲率就會漸漸變得明顯，只有在2-10 μg/ml（反應液中的濃度）這一比較小的BSA濃度跨度下才適合繪制蛋白標準曲線。這個非線性是由染料自身的特性造成的，即染料與蛋白結合前后的吸收光譜有重疊。

游離的G250染料有多個光吸收峰。在反應條件下，染料處于酸性環(huán)境中，此時染料有紅、藍、綠三種顏色形式，處于平衡狀態(tài)，這三種顏色形式分別對應的吸收峰為470、590、650 nm。與蛋白結合的染料分子是藍色形式，吸收峰在590 nm，其與蛋白結合后產生的復合物吸收峰在594 nm。這也就意味著，在以594 nm波長進行檢測時，有部分光吸收值是由游離染料產生的，這部分光吸收值是作為檢測背景存在的。在反應過程中，隨著蛋白與染料的結合，游離染料分子的濃度下降，使得594 nm檢測背景值降低，從而引起線性關系的扭曲。下圖顯示了游離染料和染料-蛋白復合物的光吸收譜。

這種線性關系的扭曲，可以通過不同的計算方法進行修正。由于游離染料的三種顏色形式處于平衡狀態(tài)，因此，可以通過在450 nm檢測紅色形式的染料，間接判斷594 nm檢測背景的下降程度。由于反應過程中蛋白和游離染料的濃度變化都會對反應的線性關系造成影響，根據比爾定律，采用OD594與OD450的比值進行公式計算，可以獲得與蛋白濃度的線性關系，同時還可以提高蛋白標準曲線的斜率，以及一定程度上提高檢測靈敏度。實驗范例見下圖，理論推導過程在此省略，感興趣的朋友可閱讀下文所附的參考文獻。

（圖中BSA蛋白濃度為反應液中的濃度）

使用OD594/OD450擬合時，需要注意，此時的背景值是指水的光吸收值，并非不含蛋白的染色液的光吸收值。如缺乏合適濾光片，也可使用590-600 nm和450-485 nm（染料-蛋白復合物在485 nm以下波長沒有光吸收）的任意波長進行讀數。

參考文獻：Linearization of the Bradford Protein Assay Increases Its Sensitivity: Theoretical and Experimental Studies，ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 236, 302–308 (1996)