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齊一生物科技（上海）有限公司技術(shù)部報(bào)道：

通過大腸桿菌表達(dá)目的基因大量獲得重組蛋白是一個方便快捷的方法。植物中克隆的目的基因被克隆到特異設(shè)計(jì)的質(zhì)粒載體上，受噬菌體T7強(qiáng)啟動子控制；表達(dá)由宿主細(xì)胞提供的T7 RNA聚合酶誘導(dǎo)。當(dāng)需要表達(dá)蛋白時，在細(xì)菌培養(yǎng)基中加入IPTG來啟動表達(dá)。不同載體在鄰近克隆位點(diǎn)處具有編碼不同的多肽“標(biāo)簽"的序列，在定位、檢測或純化目的蛋白時提供方便。
以pET-32a(+)為例，介紹將目的基因克隆進(jìn)載體并進(jìn)行表達(dá)獲得重組蛋白的過程，從而熟悉根據(jù)自己的要求采用不同的載體進(jìn)行原核表達(dá)的全過程。

1.準(zhǔn)備工作（試劑配置和器材準(zhǔn)備）
1) 操作流程示意圖
主要步驟 操作
①制備pET-32a(+)載體 用限制性酶消化，去磷酸化后膠純化回收
②制備插入DNA PCR裝入質(zhì)粒后進(jìn)行限制性消化，再回收
③插入片段克隆到pET-32a(+)載體 插入片段與pET連接，轉(zhuǎn)化
④轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21 轉(zhuǎn)化帶有T7RNA聚合酶基因的菌株
⑤ 誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白 SDS-PAGE，Western 印跡、定量分析確定目的蛋白
⑥放大試驗(yàn)純化目的蛋白 放大試驗(yàn)，制備粗提物，親和純化，切除融合標(biāo)簽
2) 配制生長培養(yǎng)基如LB，和100mM IPTG, 50ug/ml 卡那霉素存儲液。
3) 宿主菌的保存。長期存放菌株和pET重組子應(yīng)保存于甘油中。
4) 感受態(tài)細(xì)胞的制備，參照其它試驗(yàn)手冊。http://www.bbioo。。ｃｏｍ/

2. 操作步驟
[1] 制備載體
1） 載體消化和膠純化
3ug pET載體
3ul 10×限制性內(nèi)切酶buffer
10-20U 兩種酶（是否共用buffer; 酶體積不要超過反應(yīng)體系的10％）
3ul 1mg/ml乙酰BSA（根據(jù)需要）
補(bǔ)足水到30ul
2) 37℃溫浴2-4h
3) 取3ul樣品進(jìn)行電泳檢測消化反應(yīng)進(jìn)行的程度
4) 消化*后，加入0.05U小牛堿性磷酸酶，37℃ 30min
5) 全部樣品在1％瓊脂糖膠上電泳，切帶按照膠回收試劑盒說明回收目標(biāo)片段。
6) -20℃保存?zhèn)溆谩?br>[2] 制備插入片段
限制性消化和膠純化是制備插入片段的常規(guī)方法。一般先用PCR擴(kuò)增帶酶切位點(diǎn)的目標(biāo)基因，克隆進(jìn)T－載體，然后用與消化載體相同的內(nèi)切酶進(jìn)行消化和膠回收。但在PCR過程中，需要減少突變的發(fā)生，可采用高保真酶，盡量減少PCR循環(huán)次數(shù)，增加模板和引物的濃度。
[3]在pET32a載體中插入片段
連接反應(yīng)
2ul 10×連接buffer
2-5ul 50ng/ul 預(yù)制的pET32a載體
1ul T4連接酶
5-7ul 預(yù)制目標(biāo)基因插入片段
加水到20ul，槍頭混勻，16℃反應(yīng)2h－過夜
[4]轉(zhuǎn)化
轉(zhuǎn)化方法同T－載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α一樣，既可轉(zhuǎn)化BL21也可轉(zhuǎn)化 DH5α，若轉(zhuǎn)化DH5α，需要重新抽提質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化BL21。篩選LB平板需含50ug/ul 卡那霉素。
[5]pET重組子鑒定
如果亞克隆成功，陽性菌落數(shù)遠(yuǎn)大于陰性菌落。檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化子的方法很多，包括PCR、質(zhì)粒抽提及酶切分析、測序，體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。
[6]DE3 溶原菌的誘導(dǎo)表達(dá)
（1）、從新鮮的劃線平板中挑取單克隆到50ml含50ug/ul 卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.4-1。
（2）、培養(yǎng)基中加入100mMIPTG 至終濃度為0.4mM（T7啟動子）或1 mM（T7lac啟動子），繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時。
（3）、將搖瓶置于冰上5min，5000g 4℃離心5min收集菌體。
（4）、重懸細(xì)胞于0.25倍體積預(yù)冷的20mMTris-HCl （pH8.0）中，離心。
（5）、除去上清，菌體保存于-70℃或繼續(xù)純化。
[7]SDS-PAGE進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)分析
（1）、機(jī)械破碎細(xì)胞。一般用弗氏壓碎法或超聲波處理。http://www.qiyibio。。ｃｏｍ/
（2）、裂解液14000g離心10min，分離可溶和不溶部分。
（3）100ul可溶上清中加入100ul 4×SDS上樣buffer和水。85℃迅速加熱3min使蛋白變性，然后上樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，觀察蛋白表達(dá)。
（4）若目標(biāo)蛋白在不溶部分中，需進(jìn)行包涵體純化。750ul20mMTris-HCl, pH7.5重懸沉淀，離心10000g5min, 除去上清重復(fù)洗滌。然后1.5ml 1％SDS上樣buffer中重懸沉淀，重復(fù)（3）的步驟進(jìn)行SDS-PAGE分析。

3.總結(jié)（注意事項(xiàng)）
(1) 所有操作盡量在冰上操作，以避免蛋白質(zhì)發(fā)生變性；http://www.qiyibio。。ｃｏｍ/
(2) 根據(jù)自己的需要選擇不同的表達(dá)載體，并注意不同的表達(dá)載體上的融合標(biāo)簽和攜帶的抗性基因，其中有些標(biāo)簽是可以去除的。具體的序列和說明都可以從www.novagen。。ｃｏｍ中下載。
(3) 構(gòu)建好的載體進(jìn)行測序驗(yàn)證，保證讀碼框正確，即沒有移碼。
(4) 長期保存的pET重組子在高濃度甘油（19％）中會導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定。
(5) T7lac啟動子是嚴(yán)謹(jǐn)啟動子，IPTG誘導(dǎo)時可以優(yōu)化佳濃度（25uM-1mM之間）使目的蛋白達(dá)到佳的活性和溶解性。
(6) 37℃生長常常會使一些蛋白累積形成包涵體，而30℃生長則可能產(chǎn)生可溶的和有活性的蛋白。在某些情況下，低溫（15－20℃）延長誘導(dǎo)時間（過夜）可以使溶解性蛋白的產(chǎn)量達(dá)到zui大。
(7) 進(jìn)行SDS-PAGE分析時，需優(yōu)化電泳上樣體積。