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ELISA檢測(cè)肺炎支原體抗體IgM
[檢測(cè)方法] ELISA
[方法學(xué)原理] 將微孔表面包被純化的肺炎支原體抗原，將被稀釋過(guò)的患者血清加入微孔中，如存在支原體抗體可與微孔上抗原相結(jié)合，然后洗去未結(jié)合物質(zhì)，再加入酶標(biāo)記抗人IgM與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)記抗體，zui后加入顯色液。在特定時(shí)間終止顯色反應(yīng)，通過(guò)酶標(biāo)儀校正和對(duì)照相比讀出結(jié)果。
[標(biāo)本準(zhǔn)備] 取新鮮末梢血或靜脈血。如采血后24h內(nèi)不能進(jìn)行試驗(yàn)，分離血清后將其保存于一20℃環(huán)境中。檢測(cè)時(shí)，使樣本恢復(fù)至室溫。
[試劑]
1．預(yù)包被微孔板
2．陽(yáng)性對(duì)照
3．弱陽(yáng)性對(duì)照
4．陰性對(duì)照
5．標(biāo)本稀釋液
6．濃縮酶聯(lián)物
7．底物A、B
8．終止液
[儀器] 酶標(biāo)儀或全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。
[檢測(cè)步驟]
1．配制洗滌液 1瓶濃縮洗滌液加475ml蒸餾水。配好的洗滌液短期內(nèi)可置室溫環(huán)境，長(zhǎng)期可存于2—8℃環(huán)境中。
2．配制酶聯(lián)物 按1：101倍稀釋?zhuān)慈?0tzl濃縮酶聯(lián)物加酶聯(lián)物稀釋液l 000ul(根據(jù)檢測(cè)標(biāo)本數(shù)量確定稀釋量)，未用完的丟棄。
3．待試劑盒平衡至室溫后，待測(cè)標(biāo)本用按1：51稀釋?zhuān)?ul血清與200u1標(biāo)本稀釋液混合。
4．將稀釋標(biāo)本置37℃環(huán)境中20min。
5．各加100ul陽(yáng)性、弱陽(yáng)性、陰性對(duì)照及已稀釋待測(cè)標(biāo)本上清液于相應(yīng)孔中，空白對(duì)照孔加100ul標(biāo)本稀釋液，蓋好反應(yīng)板，37℃環(huán)境中孵育30min。
6．甩盡板中液體，每孔用200—300ul洗滌液洗5次，每次均需拍干。
7．每孔加酶聯(lián)物100t~l，蓋好反應(yīng)板，37℃環(huán)境中30min。
8．甩盡板中液體，洗5次，每次拍干。
9．加底物A、B各1滴或各50P1，混勻，37℃環(huán)境中15min。
10．取出，加終止液1滴，用酶標(biāo)儀450nm測(cè)其OD值。若肉眼觀察，不加終止液判斷結(jié)果。
[結(jié)果判斷]
1．陰性對(duì)照平均OD值須小于0．20。
2．弱陽(yáng)性對(duì)照平均OD值須在0．20～0．65。
3．弱陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的平均OD值之比須≥2。符合以上3種條件時(shí)，本試驗(yàn)結(jié)果可信，否則重復(fù)試驗(yàn)。
4．若待測(cè)標(biāo)本孔顯色比弱陽(yáng)性對(duì)照孔深則判為陽(yáng)性，反之為陰性。但在弱陽(yáng)性對(duì)照值上下10％范圍內(nèi)再測(cè)1次，如確實(shí)高于弱陽(yáng)性對(duì)照則可判為陽(yáng)性。
[注意事項(xiàng)]
1．本試驗(yàn)結(jié)果須結(jié)合臨床表現(xiàn)、病史作出診斷，方可采取適當(dāng)臨床處理。
2．試劑盒內(nèi)雖然含有消除干擾因子的物質(zhì)，但仍可能會(huì)有少量標(biāo)本難以除盡干擾。因此，如果某標(biāo)本幾項(xiàng)IgM均為陽(yáng)性，應(yīng)考慮有RF的干擾。
[臨床意義] IgM抗體是早期抗體，于起病第1周末出現(xiàn)，用于早期診斷；IgG抗體是恢復(fù)期抗體，于起病2—3周后出現(xiàn)，動(dòng)態(tài)觀察可用于確定診斷。
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