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小鼠生殖細(xì)胞單細(xì)胞懸液制備的影響因素

2013-1-10　

　　小鼠生殖細(xì)胞單細(xì)胞懸液制備的影響因素
　　
　　良好單細(xì)胞懸液的制備必須首先考慮所用小鼠的日齡。因?yàn)殡S動(dòng)物日齡的增加，精原細(xì)胞開始分化形成各級(jí)生殖細(xì)胞，其數(shù)目及所占生殖細(xì)胞的比例都逐漸下降，會(huì)給分離純化增加困難。在成年小鼠的睪丸中，A型精原細(xì)胞只占所有精原細(xì)胞的1.25%，占未分化精原細(xì)胞的10.6%，僅占所有生殖細(xì)胞的0.03%［5］。因而用來(lái)分離精原細(xì)胞的動(dòng)物的日齡應(yīng)較小為好。一般小鼠選用生后8d的［2］，但也有人選用生后10d的；大鼠則選用生后9d的［6］。根據(jù)我們的前期工作并參考有關(guān)報(bào)道［2，3］，7～8d小鼠的生精上皮內(nèi)基本只有A型精原細(xì)胞和支持細(xì)胞，其他各級(jí)生精細(xì)胞尚未發(fā)育形成，理論上可獲得zui大量的精原細(xì)胞。
　　
　　其次，采用適當(dāng)?shù)某绦蚣跋椒ㄒ彩侵苽淞己脝渭?xì)胞懸液的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。從小鼠體內(nèi)取出睪丸之后，我們先用尖鑷仔細(xì)去除脂肪墊及睪丸白膜，將曲細(xì)精管在PBS中吹散，盡量將間質(zhì)吹打成單細(xì)胞及組織碎片。通過(guò)靜置或低速離心，將其去除，獲得較為純粹的曲細(xì)精管段。然后采用兩次較短時(shí)間的膠原酶消化，將沒有消散的睪丸間質(zhì)消散并釋放大部分管周肌樣細(xì)胞，zui大程度地減少了間質(zhì)組織及管周肌樣細(xì)胞的污染。zui后采用胰蛋白酶、EDTA復(fù)合消化液消化，釋放支持細(xì)胞和精原細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種程序性的消化過(guò)程能有效地分離到較為純粹的曲細(xì)精管段并制備出較高產(chǎn)量和活率的單細(xì)胞懸液，同時(shí)確保絕大部分間質(zhì)成分，管周肌樣細(xì)胞及睪丸外細(xì)胞的去除。


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