小鼠生殖細胞單細胞懸液制備的影響因素
良好單細胞懸液的制備必須首先考慮所用小鼠的日齡。因為隨動物日齡的增加,精原細胞開始分化形成各級生殖細胞,其數(shù)目及所占生殖細胞的比例都逐漸下降,會給分離純化增加困難。在成年小鼠的睪丸中,A型精原細胞只占所有精原細胞的1.25%,占未分化精原細胞的10.6%,僅占所有生殖細胞的0.03%[5]。因而用來分離精原細胞的動物的日齡應較小為好。一般小鼠選用生后8d的[2],但也有人選用生后10d的;大鼠則選用生后9d的[6]。根據(jù)我們的前期工作并參考有關報道[2,3],7~8d小鼠的生精上皮內基本只有A型精原細胞和支持細胞,其他各級生精細胞尚未發(fā)育形成,理論上可獲得zui大量的精原細胞。
其次,采用適當?shù)某绦蚣跋椒ㄒ彩侵苽淞己脝渭毎麘乙旱年P鍵環(huán)節(jié)之一。從小鼠體內取出睪丸之后,我們先用尖鑷仔細去除脂肪墊及睪丸白膜,將曲細精管在PBS中吹散,盡量將間質吹打成單細胞及組織碎片。通過靜置或低速離心,將其去除,獲得較為純粹的曲細精管段。然后采用兩次較短時間的膠原酶消化,將沒有消散的睪丸間質消散并釋放大部分管周肌樣細胞,zui大程度地減少了間質組織及管周肌樣細胞的污染。zui后采用胰蛋白酶、EDTA復合消化液消化,釋放支持細胞和精原細胞。實驗結果表明,這種程序性的消化過程能有效地分離到較為純粹的曲細精管段并制備出較高產量和活率的單細胞懸液,同時確保絕大部分間質成分,管周肌樣細胞及睪丸外細胞的去除。