一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容
目的：學(xué)習(xí)檢測水中大腸菌群的方法，了解大腸菌群數(shù)量與水質(zhì)狀況的關(guān)系。
內(nèi)容：1．用濾膜法檢測大腸菌群。
2．用多管發(fā)酵法檢測大腸菌群。
二、實驗材料和用具
復(fù)紅亞*培養(yǎng)基（遠藤氏培養(yǎng)基）、乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基、乳糖蛋白胨培養(yǎng)液、三倍濃乳糖蛋白胨培養(yǎng)液、伊紅美藍培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）。
微孔濾膜（孔徑0.45µm）、濾器（容量500mL）、抽氣設(shè)備、鑷子、發(fā)酵用試管、杜氏小管、培養(yǎng)皿、刻度吸管或移液管、接種環(huán)、酒精燈。
三、操作步驟
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1．自來水將自來水用火焰燒灼3min滅菌，再擰開水流水5min，以排除管道內(nèi)積存的死水，隨后用已滅菌的三角瓶接取水樣，以供檢測。
2．池水、河水或湖水將無菌的帶玻塞的小口瓶浸入距水面10～15cm深的水層中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中裝滿后，蓋好瓶塞，取出后立即進行檢測，或臨時存于冰箱，但不能超過24h。
（二）濾膜法檢測大腸菌群
l．用無菌鑷子將一無菌濾膜置于濾器的承受器當(dāng)中，將過濾杯裝于濾膜承受器上，旋緊，使接口處能密封，將真空泵與濾器下部的抽氣口連接（圖26-1）。
2．加水樣100mL于濾杯中，啟動抽真空系統(tǒng)，使水通過濾膜流到下部，水中的菌細胞被截留在濾膜上。水樣用量可適當(dāng)增減使獲得菌落適量。
3．用無菌鑷子小心將截留有細菌的濾膜取出，平移貼于復(fù)紅亞*固體培養(yǎng)基上（注意無菌操作，濾膜與培養(yǎng)基間貼緊，無氣泡），37℃培養(yǎng)16～l8h。挑選深紅色或紫紅色、帶有或不帶金屬光澤的菌落，或淡紅色、中心色較深的菌落進行涂片和革蘭氏染色觀察。
4．經(jīng)染色證實為革蘭氏陰性無芽孢桿菌者，再接種在乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)6～8h后觀察，產(chǎn)氣者證實為大腸菌群陽性。培養(yǎng)中應(yīng)及時觀察，時間過長則氣泡可能消失。
5．結(jié)果計算
水樣中總大腸菌群數(shù)/個•L-1=（濾膜生長的菌落數(shù)/過濾水樣量/mL）×100
?。V膜上菌落數(shù)以20～60個/片較為適宜）
（三）多管發(fā)酵法檢測大腸菌群
1．取5支裝有3倍濃乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的初發(fā)酵管，每管分別加入水樣10mL。另取5支裝有乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的初發(fā)酵管，每管分別加入水樣lmL。再取5支裝有乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的初發(fā)酵管，每管分別加入按1：10稀釋的水樣lmL（即相當(dāng)于原水樣0.1mL），均貼好標(biāo)簽。此即為15管法，接種待測水樣量共計55.5mL。各管搖勻后在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。
若待測水樣污染嚴重，可按上述3種梯度將水樣稀釋10倍（即分別接種原水樣1mL、0.lmL、0.01mL）、甚至100倍（即分別接種原水樣0.lmL、0.01mL、0.001mL），以提高檢測的準確度。此時，不*3倍濃乳糖蛋白胨培養(yǎng)基，全用乳糖蛋白胨培養(yǎng)基。
2．取出培養(yǎng)后的發(fā)酵管，觀察管內(nèi)發(fā)酵液顏色變?yōu)辄S色者記錄為產(chǎn)酸，杜氏小管內(nèi)有氣泡者記錄為產(chǎn)氣。將產(chǎn)酸產(chǎn)氣和只產(chǎn)酸的兩類發(fā)酵管分別劃線接種于伊紅美藍培養(yǎng)基上，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24h。挑選深紫黑色和紫黑色帶有或不帶有金屬光澤的菌落、或淡紫紅色和中心色較深的菌落，將其一部分分別取樣進行涂片和革蘭氏染色觀察。
3．經(jīng)鏡檢證實為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，則將此菌落的另一部分接種于裝有倒置杜氏小管的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的復(fù)發(fā)酵管中，每管可接種同一發(fā)酵管的典型菌落1～3個，37℃培養(yǎng)24h若為產(chǎn)酸產(chǎn)氣者表明試管內(nèi)有大腸菌群菌存在，記錄為陽性管。
4．根據(jù)3個梯度（10mL、1ml、0.1mL）每5支管中出現(xiàn)的陽性管教（即為數(shù)量指標(biāo)），查附注的“15管發(fā)酵法水中大腸菌群5次重復(fù)測數(shù)統(tǒng)計表”（表26-2）的細菌zui可能數(shù)，再乘以100即換算成1升水樣中的總大腸菌群數(shù)。
四、注意事項
認真配制不同類型培養(yǎng)基。
檢測中應(yīng)合理控制所加的水樣量。
在濾膜法中每片濾膜的菌落數(shù)以20～60個為宜。多管發(fā)酵法中水樣稀釋比例要適宜。
挑選菌落時認真選擇大腸菌群典型菌落。
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