眾所周知，Vero細(xì)胞是一種貼壁依賴性細(xì)胞，被廣泛應(yīng)用于病毒疫苗的生產(chǎn)平臺(tái)。在臺(tái)式生物反應(yīng)器中，Vero細(xì)胞通常生長(zhǎng)于球狀微載體表面。LeProlif®Sphere 球狀微載體是一種用于高產(chǎn)量培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的球狀微載體，為動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了適宜的表面，可用于懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中。
為了進(jìn)一步滿足客戶的應(yīng)用需求，我們對(duì)微載體的粒徑進(jìn)行了優(yōu)化，使粒徑范圍更加均勻。本次我們?cè)?0L的LePhinix®?EZG臺(tái)式罐反應(yīng)器中進(jìn)行了 Vero 細(xì)胞的培養(yǎng)，我們成功開(kāi)發(fā)出Vero細(xì)胞“躺平”新姿勢(shì)，進(jìn)一步證實(shí)了用 LeProlif® Sphere球狀微載體培養(yǎng) Vero 細(xì)胞生產(chǎn)疫苗的巨大潛力。
實(shí)驗(yàn)描述
在10L的LePhinix® EZG臺(tái)式罐生物反應(yīng)器中進(jìn)行了Vero細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)體積為5L，載體濃度為4 g/L，細(xì)胞接種密度為2.0×105 cells/mL。
在培養(yǎng)至第4天時(shí)達(dá)到平臺(tái)期，細(xì)胞密度達(dá)到了3.6×106 cells/mL左右。
第3天更換為2% FBS的低血清培養(yǎng)基，細(xì)胞密度和活率可在低血清培養(yǎng)條件下維持5天，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞活率維持在90%以上。
設(shè)備與耗材
在10L的LePhinix® EZG臺(tái)式罐生物反應(yīng)器中，我們對(duì)Vero細(xì)胞在粒徑優(yōu)化以及提高濃度后的LeProlif® Sphere球狀微載體上的生長(zhǎng)進(jìn)行了測(cè)試。
中間通過(guò)更換培養(yǎng)基維持細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)，在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期時(shí)更換為低血清濃度的培養(yǎng)基，模擬接毒的條件，以掌握Vero細(xì)胞在該工藝下的增殖特性，為Vero細(xì)胞在病毒制備中的應(yīng)用提供了相應(yīng)的參考。
LeProlif®? Sphere 球狀微載體
• 以交聯(lián)葡聚糖為基底，表?修飾正電荷
• 貼壁面積積約為 4400 cm2/g
• 特殊的材料表?改性?藝提高細(xì)胞貼壁率及均勻度，?持?密度灌流培養(yǎng)
• 可在臺(tái)式罐生物反應(yīng)器/?次性生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)?懸浮培養(yǎng)，方便放?
• 可將細(xì)胞從微球表?消化下來(lái)進(jìn)?收獲
LePhinix®? EZG臺(tái)式罐生物反應(yīng)器
• 球狀微載體濕熱滅菌后通過(guò)接管機(jī)無(wú)菌焊接后接?反應(yīng)器內(nèi)
• 可搭配不銹鋼篩?進(jìn)行灌流培養(yǎng)，將微載體截留在罐內(nèi)進(jìn)行換液操作或者收獲細(xì)胞
• 工作體積：1L—10L
• 以該實(shí)驗(yàn)為例，5L 的培養(yǎng)體積，載體濃度為 4 g/L，提供的細(xì)胞貼壁?積達(dá)到了88000 cm2
表1 各種細(xì)胞培養(yǎng)容器的生長(zhǎng)表面積比較
實(shí)驗(yàn)步驟
接種
種子細(xì)胞在 T培養(yǎng)瓶 和細(xì)胞???培養(yǎng)制備，最終接進(jìn) 10L LePhinix®? EZG臺(tái)式罐生物反應(yīng)器中。
Vero 細(xì)胞擴(kuò)增工藝示意圖
細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)設(shè)置
Vero細(xì)胞在臺(tái)式罐生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)?培養(yǎng)，通過(guò)LePhinix®? EZG臺(tái)式罐生物反應(yīng)器的控制器進(jìn)行控制。
表2 工藝參數(shù)和設(shè)定值
測(cè)試結(jié)果
4 g/L 的載體濃度，2.0×105Cells/mL 的細(xì)胞接種密度，培養(yǎng)體積為 5L，培養(yǎng)8天，Day 0-Day 4 為細(xì)胞擴(kuò)增階段，Day 2 換液1個(gè)VVD，Day 3 更換為無(wú)?清培養(yǎng)基，因沒(méi)有?無(wú)?清培養(yǎng)基清洗微載體，徹底置換原培養(yǎng)基，因此更換??清培養(yǎng)基后整個(gè)培養(yǎng)體系的?清濃度為 2% 左右，Day 4 到達(dá)平臺(tái)期，平臺(tái)期的細(xì)胞密度約為 3.6×106 cells/mL，該細(xì)胞密度維持至 Day8，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞活率維持在 90% 以上，細(xì)胞密度和活率的結(jié)果?圖4，細(xì)胞貼壁效果見(jiàn)圖5。
Vero 細(xì)胞培養(yǎng)活細(xì)胞密度和活率
Vero 細(xì)胞在球狀微載體上不同時(shí)期的貼壁狀態(tài)
測(cè)試結(jié)論
4g/L的載體濃度下，Vero 細(xì)胞在罐內(nèi)培養(yǎng)?第 4 天達(dá)到了3.6×106 cells/mL左右的細(xì)胞密度，并可以在 2% 低?清濃度下維持 5 天，顯示了 Vero 細(xì)胞在病毒制備中的巨大潛力，為接種病毒時(shí)期提供了重要的參考數(shù)據(jù)。
LePhinix®? EZG臺(tái)式罐生物反應(yīng)器可以很好地支持 LeProlif® Sphere 球狀微載體的 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)，搭配不銹鋼篩?實(shí)現(xiàn)灌流培養(yǎng)，可根據(jù)客戶不同載體濃度的需求改變攪拌槳葉的尺?和數(shù)量，為客戶實(shí)現(xiàn)定制化服務(wù)，并實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控制。
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