雙特異性抗體，可同時結合兩種不同的靶點，從而達到相應的治療效果，相比于但特異性抗體，雙抗具有特異性強，副作用小的優(yōu)點，因此雙特異性抗體成為各大藥企競爭的焦點，值得注意的是僅2022年就有5款雙特異性抗體獲批上市(表1)，然而與單抗相比，雙抗的表達過程會存在更多的副產(chǎn)物如半抗體、3/4抗體、同源二聚體、輕鏈缺失、單臂缺失以及聚集體等副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物的存在嚴重干擾雙特異性抗體的有效性以及安全性。本文從下游純化的角度綜述了親和層析、離子交換層析、混合模式層析以及疏水和分子篩用于去除副產(chǎn)物的策略。

 

 

　　親和層析
 

　　Protein A親和層析法可以說是雙特異性抗體下游加工中常用的捕獲純化方法之一。這種純化是通過Protein A與靶分子的Fc區(qū)以及重鏈可變結構域區(qū)相互作用從而實現(xiàn)抗體的捕獲作用。樣品通常在pH7.0-7.4的平衡步驟后進行上樣，然后通常使用平衡緩沖液洗滌步驟(用于去除未結合雜質(zhì))，在低pH<4.0時使用醋酸鹽、檸檬酸或甘氨酸緩沖液進行等度洗脫或梯度洗脫用于去除雜質(zhì)。除了具有捕獲作用外，Protein A還具有一定雜質(zhì)去除能力。具體來看Protein A親和層析具有一定的同源二聚錯配去除能力，這部分去除能力是基于兩條重鏈對于protein A存在親和力差異。最典型是FcFc*型雙特異性抗體，其中Fc*通過基因工程的手段消除了protein A結合能力，因此雙抗分子對protein A結合能力介于Fc* Fc*以及FcFc之間，其中Fc* Fc*與protein A不結合隨流穿液去除，而FcFc與protein A結合里較強，通常需要通過再生步驟進行去除。其次protein A 親和層析基于親和力差異，對半抗體以及3/4抗體以及單臂缺失副產(chǎn)物具有較好的去除能力，如圖1所示，protein A 通過pH梯度洗實驗，可以有效將主峰與半抗體(A)，單臂缺失抗體(B)以及3/4抗體(C)相分離。此外，如圖2所示，在洗脫緩沖液中添加，300mM CaCl2或者500 mM NaCl可以顯著提高主峰與半抗體的分辨率。此外，在protein A親和層析過程中，在淋洗以及洗脫液添加一定量的CaCl2以及聚乙二醇，可以有效去除聚集體，如圖3所示，在洗脫液中添加5%PEG以及500mM CaCl2,可以使得單體的含量在95%以上。

 

 

 

 

 

 

　　離子交換色譜
 

　　基于電荷的純化通常以離子交換色譜的形式作為精純步驟，通常用來純化電荷異構體以及具有電荷差異的錯配體。因此選用離子交換色譜前考慮目標分子的等電點是很重要的，一般來說緩沖液的pH距離目標分子等電點1-3個單位。由于大多數(shù)雙抗的等電點在6.0-8.0之間，因此優(yōu)先推薦使用陰離子層析的流穿模式以及陽離子層析的結合洗脫模式。具體來看，陽離子層析結合洗脫模式配以pH線性梯度洗脫，對等電點差異較小的副產(chǎn)物具有較好的分辨率。如圖4所示，Mono S 5/50GL 結合pH4.0 到 11.0的pH梯度對pI相差僅為0.4的副產(chǎn)物具有較好的分辨率。陰離子層析流穿模式通?？梢匀コ入婞c小于目標抗體的副產(chǎn)物，(在層析過程中，pI較小的副產(chǎn)物會結合在陰離子層析柱上)，此外，對于等電點差距較小的副產(chǎn)物，也會存在一種特殊的弱結合作用力，通過陰離子層析進行去除。

 

 

　　混合模式層析
 

　　混合模式層析通常是指同時具有兩種及以上作用力的層析模式，常用于雙特異性抗體純化的有陽離子層析+疏水作用，以及陰離層析+疏水作用。目前有部分研究證明，混合模式層析可以用于替代protein A親和層析進行雙抗捕獲。此外，相對于傳統(tǒng)的離子交換，混合模式層析可以提供更寬泛的操作空間，以及較高的分辨率。如圖5所示，Capto MMC一步層析過程可以有效將半抗體以及同源二聚體相互分離。與此同時，由于同時具備兩種以上的作用力，混合模式的工藝開發(fā)也存在著一定的挑戰(zhàn)。此外，混合模式層析對輕鏈缺失副產(chǎn)物也有較好的去除效果，如圖6所示，Capto MMC配以0-1M NaCl線性梯度，可有效去除輕鏈缺失副產(chǎn)物。近年來pH-NaCl雙梯度的策略，也常?？梢娪诨旌夏Ｊ焦に囬_發(fā)。如圖7，所示Capto MMC 配以0-250mM NaCl、pH6.0-8.5 雙梯度可以有效分離半抗體、單臂缺失副產(chǎn)物以及輕鏈缺失副產(chǎn)物。

 

 

 

 

 

 

　　疏水層析以及尺寸排阻色譜
 

　　疏水層析主要依據(jù)蛋白表面疏水性差異進行分離純化，通常在上樣階段需要添加高濃度的鹽，如硫酸銨來促進目標抗體與疏水層析介質(zhì)相互作用，通常來說疏水層析主要用于聚集體的去除。但是由于疏水層析收率低，并且重復性較差因此很好應用于雙特異性抗體的商業(yè)化生產(chǎn)中。
 

　　尺寸排阻色譜(SEC)通過分子量的差異來進行分離純化，有研就表明，Zenix SEC-300可以有效去除聚集體，然而SEC通常需要較高的柱高，這就導致需要較高體積的層析緩沖液以及較長的工藝時間，因此SEC也很少應用于雙特異性抗體商業(yè)化純化生產(chǎn)階段，而更多可用于質(zhì)量分析模塊。
 

　　總結
 

　　隨著第九款雙特異性抗體的上市，雙抗賽道的競爭則更加激烈，相比于單抗來說，雙特異性抗體副產(chǎn)物多，下游純化難度大，因此制定合適的策略尤為重要，本文系統(tǒng)總結了雙抗副產(chǎn)物的去除策略可為雙抗下游純化提供參考。