蛋白純化的挑戰(zhàn)是不言而喻的，鑒于表達(dá)宿主中存在復(fù)雜的生物大分子混合物，通常需要進(jìn)行重組蛋白的提取。隨著新一代色譜介質(zhì)和自動(dòng)化系統(tǒng)的出現(xiàn)，過去研究人員需要花費(fèi)幾個(gè)月時(shí)間來建立一個(gè)蛋白純化操作流程的日子已經(jīng)一去不復(fù)返了。然而，并不是所有的問題都可以用復(fù)雜的色譜柱填料和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備來解決。在尋找樣本預(yù)處理的最佳條件，選擇合適的緩沖條件，或處理蛋白質(zhì)的不溶性時(shí)仍存在困難。
 

　　在開始純化蛋白質(zhì)之前，我們應(yīng)首先了解所純化蛋白質(zhì)的用途、純度、所需的濃度以及儲(chǔ)存條件。在設(shè)計(jì)和確定一個(gè)經(jīng)濟(jì)、省時(shí)且能進(jìn)行大量目的蛋白純化的方案時(shí)，所有因素都是至關(guān)重要的。

 

　　蛋白質(zhì)的原料
 

　　雖然從蛋白質(zhì)的天然來源中進(jìn)行蛋白純化是相對(duì)常見的，但隨著近年來基因操作和重組表達(dá)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白進(jìn)行過表達(dá)，現(xiàn)有的過表達(dá)系統(tǒng)包括大腸、酵母、昆蟲及哺乳細(xì)胞。每種宿主表達(dá)系統(tǒng)都有各自的優(yōu)勢(shì)和不足。例如，E. coli系統(tǒng)具有最高的表達(dá)量，一般的平均產(chǎn)量有2.5 g/L，但是它缺乏任何的翻譯后修飾。另外，如果蛋白需要糖基化，那么相較于昆蟲和哺乳細(xì)胞，酵母系統(tǒng)可以提供大量的糖基化修飾。表達(dá)系統(tǒng)的選擇依賴于蛋白自身的特性以及它的下游應(yīng)用。
 

　　提取方法
 

　　大多數(shù)情況下，提取過程取決于蛋白質(zhì)的來源，它可能是細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也可能是胞內(nèi)/胞外。從細(xì)胞內(nèi)提取蛋白往往面臨著回收率和純度低的問題。提取的主要目標(biāo)應(yīng)該是獲得不降解或不變性的的所需蛋白質(zhì)，且污染物極少甚至沒有。
 

　　通常對(duì)提取培養(yǎng)基、時(shí)間、溫度、裂解設(shè)備及能量輸入(攪拌速度、壓力等)等參數(shù)進(jìn)行策略性改變來優(yōu)化提取方案。需要注意的是，方法的選擇應(yīng)該是盡可能溫和的，因?yàn)檫^于劇烈或苛刻的條件可能會(huì)使所需要的蛋白質(zhì)變性或釋放內(nèi)蛋白水解酶，并引起普遍的酸化。提取過程中無法回避的主要問題之一是蛋白水解或核酸污染。然而，通過在提取培養(yǎng)基中加入核酸酶或蛋白抑制劑，且在低溫環(huán)境下操作可在某些程度上避免蛋白水解和核酸污染。因此，對(duì)于優(yōu)化設(shè)計(jì)來說，為了使蛋白質(zhì)的含量和活性更大化，在小范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化初步實(shí)驗(yàn)是非常必要的，之后可以有效放大。
 

　　提取試劑的組成應(yīng)該能使蛋白保持穩(wěn)定，并以最大的回收率和純度使蛋白從細(xì)胞中有效釋放出來。當(dāng)在制備提取試劑或裂解緩沖液時(shí)應(yīng)考慮下述因素：緩沖液鹽濃度、pH、還原劑、變性劑、去污劑、金屬離子、蛋白酶抑制劑和DNA酶。
 

　　溶解度和純化策略設(shè)計(jì)
 

　　蛋白的溶解度
 

　　在任何蛋白的純化中，蛋白溶解度都是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。不同蛋白間的溶解度明顯不同，其高度依賴于蛋白的物理化學(xué)特性及其所處的溶劑。很大程度影響蛋白溶解度的參數(shù)包括溶劑的pH、離子強(qiáng)度、溫度，以及蛋白表面暴露的氨基酸側(cè)鏈類型。在溶劑中帶有電荷較少的蛋白和含有疏水氨基酸的蛋白通常是難溶的。由于很難準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蛋白的溶解特性，我們應(yīng)該通過改變不同的條件，并結(jié)合表明不同條件下蛋白溶解度的SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果，仔細(xì)設(shè)計(jì)蛋白的初步研究。
 

　　鹽析
 

　　鹽析，通常被稱為鹽誘導(dǎo)的沉淀或鹽分餾法，其主要基于蛋白與鹽的相互作用。鹽傾向于在水溶液(溶劑)中解離分解，這是鹽析過程發(fā)生的基礎(chǔ)。當(dāng)鹽濃度升高，鹽離子逐漸與水分子結(jié)合，同時(shí)導(dǎo)致與蛋白帶電部分結(jié)合的水分子數(shù)量減少。最終，由于蛋白間的相互作用強(qiáng)于蛋白與溶劑的相互作用，所以蛋白質(zhì)分子間趨向于相互作用，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和隨后的沉淀。這個(gè)過程稱為鹽析(圖2)。重要的是，不同蛋白通過鹽析進(jìn)行蛋白沉淀時(shí)所需的鹽濃度是不一樣的。硫酸銨是進(jìn)行蛋白沉淀常用的鹽之一。

 

 

　　鹽溶
 

　　蛋白溶解度受溶液中離子強(qiáng)度的影響。如果把蛋白質(zhì)放在像水一樣的水溶液中，那么溶液中唯一的離子成分就是蛋白質(zhì)分子。雖然水是極性的，但它只會(huì)輕微電離，因此蛋白質(zhì)由于蛋白分子間的離子相互作用而趨向聚集。相比于蛋白質(zhì)-水間的相互作用，蛋白-蛋白間的相互作用更易導(dǎo)致不可逆的聚集。NaCl等鹽離子濃度較低時(shí)，其他離子的出現(xiàn)可以與離子的蛋白間相互作用產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)。溶液中的這些離子往往保護(hù)蛋白分子不受其他蛋白分子的電荷影響。蛋白分子間靜電作用的減弱，最終增加了蛋白的溶解度，被稱之為“鹽溶”。然而，當(dāng)離子強(qiáng)度開始變得過高時(shí)，它會(huì)對(duì)蛋白的溶解度產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致“鹽析”。
 

　　蛋白的鹽溶通常發(fā)生在其等電點(diǎn)(pI)附近。除了靜電效應(yīng)外，蛋白表面有限的電荷也會(huì)影響與蛋白相關(guān)的水分子?？偠灾}離子與蛋白分子的電荷基團(tuán)結(jié)合增加了蛋白的溶解度，從而導(dǎo)致蛋白的“鹽溶”。
 

　　包涵體蛋白的處理
 

　　在E.coli中進(jìn)行重組蛋白的大量表達(dá)時(shí)往往會(huì)形成不可溶的和聚集的蛋白，這些蛋白被稱為“包涵體”。除了不可溶之外，包涵體也沒有蛋白的天然構(gòu)象，因此，這就要求對(duì)包涵體進(jìn)行溶解處理和重折疊，以使目的蛋白具有天然構(gòu)象。這通常需要大量的優(yōu)化，而且非常耗時(shí)。此外，在蛋白重折疊過程中，蛋白量可能會(huì)出現(xiàn)明顯的損失。通過改變蛋白表達(dá)中的幾個(gè)條件來避免E.coli中包涵體的形成。在多數(shù)情況下，往往通過低溫(如18℃)和低于0.5 mM IPTG(異丙基硫半乳糖苷)誘導(dǎo)表達(dá)來處理包涵體形成的問題。
 

　　對(duì)于包涵體的分離，收集表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞，機(jī)械裂解，然后在4℃條件下高速(20000 g)離心15 min。離心獲得的沉淀即為包涵體。然后用去污劑對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌，如1% Triton-X，隨后用8 M尿素或6 M鹽酸胍等化學(xué)變性劑對(duì)蛋白進(jìn)行變性處理。變性步驟可重復(fù)多次直至獲得最大回收率。包涵體經(jīng)過這些步驟處理后往往有大于90%的純度。若目的蛋白中含有雜質(zhì)，可以進(jìn)行親和層析純化或鹽析沉淀以增加它的純度。通過稀釋或透析的方式逐漸移除變性劑，使變性后的蛋白進(jìn)行重折疊。
 

　　變性蛋白在重折疊過程中的一些關(guān)鍵參數(shù)包括溫度、pH、還原劑(如DTT、TCEP)和添加劑(往往結(jié)合使用)。然而，對(duì)于成功的重折疊來說，更重要的是要進(jìn)行多次條件摸索和后續(xù)的條件優(yōu)化。蛋白重折疊的成功率往往是不盡如人意的。因此，需要測(cè)試大量的重折疊條件，以便獲得大量高純度且具有生物活性的蛋白質(zhì)。除了稀釋或透析方法外，未折疊蛋白溶液中的變性劑也可以用不同的層析技術(shù)去除。
 

　　層析法的概述
 

　　柱層析，通常使用液相色譜法(LC)進(jìn)行重組蛋白的純化。層析法中，固定相被填充在層析柱上，利用泵或重力流使得液體流動(dòng)相通過層析柱。樣品混合物在層析柱的一端引入，隨著流動(dòng)相在層析柱的另一端被洗脫下來。混合物中各組分的分離取決于分子在固定相和流動(dòng)相之間的分配，而這主要是基于它們分子量的差異。為了目的蛋白獲得令人滿意的純度和均一性，通常使用親和層析、離子交換層析，以及體積排阻色譜等技術(shù)對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。
 

　　親和層析
 

　　有基于親和的多種方法被用于純化重組蛋白?；谟H和純化的常用策略是融合標(biāo)簽(例如，添加在重組蛋白上的氨基酸序列)的使用，標(biāo)簽對(duì)固定在層析柱上的配體有親和性。表1列舉了一些常用的標(biāo)簽。
 

　　表1 用于重組蛋白純化的常用融合標(biāo)簽

 

　　注：AC：親和層析，IEX：離子交換層析，a.a.：氨基酸，kDa：千道爾頓
 

　　特別是，組氨酸(His)標(biāo)簽(由6個(gè)或更多組氨酸殘基構(gòu)成的多肽序列)可以添加在重組蛋白的N端或C端，其通常用于從細(xì)胞裂解獲得的蛋白混合物中純化目的蛋白。His標(biāo)簽標(biāo)記的蛋白對(duì)二價(jià)金屬離子(如Ni+2或Zn+2)具有親和性，因此，這種層析技術(shù)又稱為固定化金屬親和層析(IMAC)。IMAC系統(tǒng)的主要優(yōu)勢(shì)是它能接受寬泛的緩沖條件，包括去污劑和化學(xué)變性劑等添加劑的存在。此外，樹脂可以再生，并且可以重復(fù)使用幾次，因此，能夠使學(xué)術(shù)界和工業(yè)界發(fā)展經(jīng)濟(jì)的純化策略。圖3提供了Ni-NTA親和層析的示意圖。

 

 

　　多聚組氨酸標(biāo)簽最主要的缺點(diǎn)之一是蛋白和IMAC柱的非特異性結(jié)合。然而，由于分子量很小，所以His標(biāo)簽也有一些優(yōu)勢(shì)，比如它幾乎不會(huì)影響蛋白功能。大多數(shù)情況下，僅一步純化即可將蛋白純度提升至90-95%。IMAC樹脂不受細(xì)胞裂解產(chǎn)物中蛋白酶和核酸酶的影響，這使得它適用于粗提取物的純化。His標(biāo)簽的優(yōu)勢(shì)之一是它可與其他親和標(biāo)簽(見表1)聯(lián)合使用，實(shí)現(xiàn)對(duì)同一蛋白的標(biāo)記，為純化過程提供了很靈活的選擇空間?？傊噍^于基于親和的其他純化方法，IMAC是一種快速且便宜的純化方法。
 

　　與多聚組氨酸標(biāo)簽類似，其他可選擇的親和標(biāo)簽，如MBP或GST也被頻繁使用；然而，由于這些標(biāo)簽的分子量較大，可通過在標(biāo)簽和目的蛋白間引入特定的酶切位點(diǎn)，以便在后續(xù)的處理中將標(biāo)簽去除。由于大標(biāo)簽涉及額外的處理步驟，因此這些大標(biāo)簽的使用增加了純化重組蛋白的后續(xù)處理成本。
 

　　離子交換層析(IEX)
 

　　IEX是基于蛋白帶電基團(tuán)與柱基質(zhì)間的靜電相互作用。IEX中蛋白的分離取決于蛋白表面的電荷、流動(dòng)相的pH和鹽濃度。IEX普遍應(yīng)用于未帶標(biāo)簽重組蛋白的純化。蛋白質(zhì)與層析柱的結(jié)合依賴于蛋白質(zhì)表面電荷和柱基質(zhì)所帶電荷間的相互作用(圖4a)。這種相互作用是可逆的，可以通過鹽的線性梯度或改變pH來破壞這種作用，從而使層析柱上結(jié)合的蛋白被洗脫下來。
 

　　在溫和的條件下，IEX為重組蛋白提供高的結(jié)合能力和分離分辨率。另外，由于IEX具有可放大(尤其是對(duì)重組蛋白)，價(jià)格適中，廣泛的適用性等優(yōu)點(diǎn)，已使IEX成為應(yīng)用廣泛、用途廣泛的液相色譜技術(shù)之一。

 

 

　　體積排阻色譜
 

　　體積排阻色譜(SEC)，也被稱為凝膠過濾層析，根據(jù)其流體動(dòng)力學(xué)體積和分子量的差異分離大分子。固定相由惰性球狀珠或具有特定孔徑的凝膠組成。比凝膠孔徑大的蛋白不能滲入到凝膠顆粒中，通過珠子間的空隙首先被洗脫下來。另一方面，比凝膠孔徑小的蛋白擴(kuò)散到孔隙中，洗脫時(shí)間按比例延長(zhǎng)(即從蛋白進(jìn)入到孔隙至蛋白檢出所花費(fèi)的時(shí)間。因此，SEC也被普遍稱為凝膠過濾層析。SEC中，蛋白分子不直接與流動(dòng)相發(fā)生作用，因此，緩沖液的成分不影響色譜柱的分辨率(即峰的分離程度)。相比小蛋白，大蛋白的保留時(shí)間要短，這得以實(shí)現(xiàn)蛋白分離。除了凝膠孔徑大小外，層析柱的分辨率也受柱床高度、流速、樣本體積及蛋白分子量的影響。通常來說，當(dāng)流速控制在慢速至中速，層析柱長(zhǎng)且窄，凝膠孔徑小及樣本體積小(占層析柱總體積的1-5%)時(shí)有可能獲得最高的分辨率。體積排阻色譜的總設(shè)計(jì)如圖5所示。由于SEC具有良好的脫鹽性能，因此它被廣泛應(yīng)用于重組蛋白純化中最后的精制步驟。

 

 

　　結(jié)論
 

　　重組蛋白生產(chǎn)的瓶頸是蛋白純化的成本。因此，在過去的幾十年里，研究者們?yōu)楦倪M(jìn)現(xiàn)有策略和發(fā)展新的純化方法做出了極大努力。這里，我們介紹了細(xì)菌系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白的一般純化步驟，如E.coli，它是蛋白表達(dá)理想的微生物細(xì)胞工廠之一。但E.coli系統(tǒng)適合穩(wěn)定表達(dá)折疊的球狀蛋白，對(duì)膜蛋白或膜相關(guān)蛋白的表達(dá)和純化來說往往是困難的。我們介紹了E.coli中表達(dá)和純化重組蛋白時(shí)遇見挑戰(zhàn)的可能途徑。雖然這些概述的方法中的很多種可能會(huì)在不同階段中失敗，但由于重組蛋白的表達(dá)和純化往往是蛋白特異性的，因此必須找到方法來標(biāo)準(zhǔn)化操作，且進(jìn)行廣泛的故障排除來克服這些困難。
 

　　原文來源：摘譯自Textbook on Cloning, Expression and Purification of Recombinant，Chapter 5