一、簡(jiǎn)介：

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們需要分離分析的樣品越來越復(fù)雜，尤其是多肽、蛋白質(zhì)類生物樣品的復(fù)雜性使得單一模式色譜難以滿足分離分析的要求。混合模式色譜因其獨(dú)特的分離性能，可以在一次分離中獲得與多維色譜相當(dāng)?shù)姆蛛x效果，而且可以避免多維色譜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、流動(dòng)相兼容性差、分析時(shí)間長(zhǎng)等問題，成為近年來的研究熱點(diǎn)之一。

匯通色譜代理的瑞士進(jìn)口的ZEOsphere DRP混合模式色譜填料利用反相/離子交換色譜固定相是在硅膠填料表面同時(shí)鍵合具有疏水性質(zhì)的碳鏈和具有離子交換性質(zhì)的陰離子或陽離子，將疏水作用與靜電作用相結(jié)合，使這兩種具有正交性質(zhì)的分離機(jī)理融合。在單次分離中，從而獲得更好的分離選擇性?；旌夏Ｊ浇Y(jié)合了反相色譜和離子交換色譜兩者的優(yōu)點(diǎn)，不僅對(duì)無機(jī)化合物和氨基酸有很好的分離效果，還可以應(yīng)用到核酸、多肽和蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸及轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸衍生物的分離中。

混合模式填料

          DRP-A                                     DRP-C

二、特點(diǎn)：

與傳統(tǒng)的單一模式色譜相比，混合模式ZEOsphere DRP填料所具備的主要優(yōu)點(diǎn)可歸納如下：

（1）較高的選擇性。樣品在單一模式分離較差，混合模式情況下可以更好的分離除去雜質(zhì)；

（2）顯著的高負(fù)載容量。負(fù)載量比反相色譜要高1-10倍，這可以成為半制備柱和制備色譜柱新的發(fā)展方向；

（3）更強(qiáng)的分離效率。可以替代兩個(gè)或多個(gè)單一模式色譜柱，這樣可以避免材料的浪費(fèi)和過度消費(fèi), 降低了生產(chǎn)成本；

（4）更高的收率。單次分離純度能達(dá)到95%以上，收率在70% 以上。

三、技術(shù)參數(shù)：

混合色譜固定相在分離樣品時(shí)能夠提供多重保留機(jī)理，同時(shí)可以通過改變流動(dòng)相中有機(jī)相與水相的比例、ｐＨ 值的高低、鹽濃度的大小等多種方法改變分離選擇性，同單一機(jī)理的色譜固定相相比，混合色譜固定相選擇性好、載樣量高。由于鍵合了不同數(shù)量的強(qiáng)陰離子基團(tuán)（A）和強(qiáng)陽離子基團(tuán)（C）, 與傳統(tǒng)色譜方法相比，同一表面上的離子交換功能和疏水作用均有顯著提高其中A10意味著鍵合了10%的強(qiáng)陰離子基團(tuán)，C10是鍵合了10%強(qiáng)陽離子交換基團(tuán)。 

四、方法開發(fā)要點(diǎn)

工作原理：ZEOsphere DRP混合模式色譜填料固定相是在硅膠填料表面同時(shí)鍵合具有疏水性質(zhì)的碳鏈和具有離子交換性質(zhì)的陰離子或陽離子，將疏水作用與靜電作用相結(jié)合，使這兩種具有正交性質(zhì)的分離機(jī)理融合在單次分離中，從而獲得更好的分離選擇性?；旌夏Ｊ浇Y(jié)合了反相色譜和離子交換色譜兩者的優(yōu)點(diǎn)，特別適用于多肽的純化,還可以應(yīng)用到核酸、蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸及轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸衍生物的分離中。

方法開發(fā)注意事項(xiàng)：

（1）在開法方法之前，一般需要確定目標(biāo)多肽分子量大小以及等電點(diǎn)（pI）等相關(guān)信息；

（2）混合填料利用疏水作用與靜電作用相結(jié)合，需要根據(jù)多肽的性質(zhì)選擇混合填料類型，以達(dá)到分離；

（3）確定好填料類型后，要對(duì)緩沖鹽進(jìn)行篩選，緩沖鹽pH的選擇一般根據(jù)以下原則：DRP-A系列緩沖鹽的pH小于目標(biāo)物的等電點(diǎn)（pI），pHpI+2。例如，人胰島素的pI為5.5，DRP-A>5.5-2=3.5,DRP-C>5.5+2=7.5。

（4）分離方法優(yōu)化如下：

?緩沖鹽的類型以及濃度；原則上，緩沖鹽的濃度要保持一致；

?填料不同類型的選擇以及相同類型不同鍵合基團(tuán)含量的選擇；

?有機(jī)試劑的種類；

（5）多肽粗品純化分離填料的篩選

?先了解多肽的結(jié)構(gòu)，分子量以及等電點(diǎn)等相關(guān)信息；

?以多肽的基本信息為基礎(chǔ)，選擇相對(duì)應(yīng)的填料進(jìn)行純化，如根據(jù)pI、疏水性、分子量大小選擇DRP填料的具體類型；

?在粗品穩(wěn)定的溫度、pH值范圍內(nèi)，篩選可能的HPLC條件，根據(jù)線性放大原理決定制備LC條件；

五、應(yīng)用案例-純化

是一種人樣肽-1（GLP-1）類似物，用于治療糖尿病。分子式為C172H265N43O51，分子量為3751. 20。的等電點(diǎn)（pI）是4.9，實(shí)現(xiàn)所需的由ZEOsphere DRP斥力，建議使用流動(dòng)相的pH值至少小于兩個(gè)單位pI值(4.9 - 2 = 2.9)或者至少大于兩個(gè)單位pI值(4.9 + 2 = 6.9)。由于在酸性條件下不穩(wěn)定，且樣品在堿性環(huán)境中溶解更好，故選擇堿性條件進(jìn)行分離。 

條件優(yōu)化：色譜柱和緩沖液的篩選

注：其中標(biāo)記為綠色的為選擇性比較好的，星數(shù)越高分離效果越好：

1、良好的選擇性；2、對(duì)稱的峰形；3、主峰和雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)基線分離

樣品分離：

色譜柱: ZEOsphere DRP 120 C5(10um, 120A, 10 x 250 mm)

流動(dòng)相:    

A: 150mM乙酸銨緩沖鹽:乙腈=90:10（pH8.5）

B: 150mM乙酸銨緩沖鹽:乙腈=50:50（pH8.5）

流速: 4ml/min     進(jìn)樣量:50ml    儀器: Waters2795/2487

柱溫: RT       樣品: 4mg/ml（溶于A相）   壓力: 800Psi

檢測(cè)波長(zhǎng): UV @ 280nm          梯度：0-5-40(35-35-40%B)

組分分析：

色譜柱: MultoHigh Bio C8 200-5(5um, 200A, 4.6 x 250 mm)

流動(dòng)相:    

A: 100mM磷酸二氫銨(pH3.7):乙腈=900:100 

B: 乙腈：水=800:200

流速: 1 ml/min    進(jìn)樣量: 10ul      儀器: Waters2796/2996

柱溫: 35℃       樣品: 2mg/ml      壓力: 1300Psi

檢測(cè)波長(zhǎng): UV @ 280nm      梯度：0-5-35(50-50-80%B)

粗品

組分分析

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