【??參數(shù)信息】
英文名稱：pGBKT7-53 Vector 酵母雙雜交對照載體
載體類型：酵母雙雜交系統(tǒng)載體
克隆菌株：DH5α
載體標(biāo)簽：c-Myc
篩選標(biāo)記：TRP1
啟動子：ADH1
表達宿主：酵母細胞
5'測序引物：T7: TAATACGACTCACTATAGGG
3'測序引物：根據(jù)序列設(shè)計引物
純度：≥95%
儲存條件：-20℃避光干燥
生產(chǎn)廠商：西安強化生物科技
【簡單概述】
pGBKT7-53 Vector 酵母雙雜交對照載體，其核心功能是表達 GAL4 DNA 結(jié)合域（DNA-BD）與小鼠p53 蛋白片段的融合蛋白，用于驗證酵母雙雜交系統(tǒng)的可靠性。
關(guān)鍵特征
載體結(jié)構(gòu)
融合蛋白組成：
GAL4 DNA-BD（氨基酸 1-147）：負責(zé)結(jié)合靶基因啟動子。
小鼠 p53 蛋白（氨基酸 72-390）：已知與 SV40 大 T 抗原相互作用的腫瘤抑制蛋白。
啟動子：ADH1 啟動子驅(qū)動融合蛋白的高水平表達。
標(biāo)簽：c-Myc 表位標(biāo)簽，便于抗體檢測。
克隆位點：p53 cDNA 插入 EcoRI 和 BamHI 位點之間。
載體參數(shù)
大?。?.3 kb或 8275 bp。
抗性基因：
原核抗性：Kanamycin。
真核篩選標(biāo)記：TRP1。
復(fù)制子：
pUC ori（大腸桿菌復(fù)制起點）。
2μ ori（酵母復(fù)制起點）。
來源
p53 cDNA 源自 Lwabuchi 等（1993）描述的質(zhì)粒，經(jīng) Clontech 改造。。
【使用方法】
一、載體特性與用途
載體本質(zhì)：
編碼 GAL4 DNA結(jié)合域（BD, 1-147aa） 與 小鼠p53蛋白（72-390aa） 的融合蛋白，用于模擬已知蛋白質(zhì)相互作用（如p53與SV40大T抗原）。
作為陽性對照，驗證酵母雙雜交系統(tǒng)的可靠性（例如：當(dāng)與pGADT7-T共轉(zhuǎn)化時，應(yīng)激活報告基因）。
二、實驗步驟
（一）載體準(zhǔn)備
質(zhì)粒溶解：
收到凍干粉后，5000 rpm離心1分鐘，加入20 μl無菌水重懸，室溫放置1分鐘。
測定濃度（建議≥100 ng/μl），保存于-20℃。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（大腸桿菌）：
將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 DH5α 等感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)，Kan（50 μg/ml）篩選。
挑取單菌落擴增，提取高純度質(zhì)粒備用（避免直接使用凍干粉）。
（二）酵母轉(zhuǎn)化與對照實驗
酵母感受態(tài)制備：
使用 Y2HGold 或 AH109 等標(biāo)準(zhǔn)酵母菌株，制備感受態(tài)細胞（如LiAc/PEG法）。
共轉(zhuǎn)化（陽性對照設(shè)置）：
實驗組：pGBKT7-53（誘餌） + pGADT7-T（獵物，編碼SV40 T抗原）。
陰性對照：
pGBKT7-53 + 空pGADT7載體
pGBKT7-Lam（編碼Lamin C，無互作） + pGADT7-T。
轉(zhuǎn)化操作：
將質(zhì)粒（0.1–1 μg）與感受態(tài)酵母混合，熱激（42℃, 15分鐘），涂布于 SD/-Trp 平板（篩選pGBKT7-53轉(zhuǎn)化子）。
30℃培養(yǎng)3–5天，挑取直徑≥2 mm的單菌落。
（三）自激活與毒性檢測（關(guān)鍵質(zhì)控）
自激活測試：
將含pGBKT7-53的酵母菌落接種至：
SD/-Trp（基礎(chǔ)篩選）
SD/-Trp/-His/X-α-Gal（或 QDO/X/A 培養(yǎng)基）。
若在缺陷培養(yǎng)基上生長并顯藍色（報告基因激活），說明p53融合蛋白可能自激活，需調(diào)整3AT濃度抑制。
毒性檢測：
比較轉(zhuǎn)化子與空載體對照的生長速度，若生長延遲則提示蛋白毒性。
（四）互作篩選（以篩庫為例）
交配法（Mating）：
將含pGBKT7-53的 Y2HGold 菌株與含文庫（pGADT7-XXX）的 Y187 菌株混合，30℃培養(yǎng)24–48小時。
涂布于 DDO（SD/-Leu/-Trp） 和 QDO（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal） 平板，篩選陽性克?。≦DO上生長且顯藍）。
陽性克隆驗證：
菌落PCR：使用載體特異性引物（如T7啟動子引物）擴增插入片段。
測序鑒定：排除重復(fù)克隆，比對序列確認互作蛋白。
點對點驗證：將候選獵物質(zhì)粒與pGBKT7-53再次共轉(zhuǎn)化，重復(fù)互作實驗。
【相關(guān)試劑】
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本試劑僅適用于科研實驗，敬請知悉。
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