ELISA實驗中客戶最常遇到的各類實操與結(jié)果異常問題

　　針對ELISA實驗中客戶最常遇到的各類實操與結(jié)果異常問題，天正信達整理了覆蓋全流程的排查方案，幫你解決問題。

　　樣本處理類常見問題

　　RIPA裂解液樣本能否直接用于檢測?：可以直接檢測，但需將裂解液稀釋至少10倍，把SDS濃度降至≤0.01%，避免高濃度去污劑破壞抗體結(jié)合體系。

　　樣本保存后結(jié)果偏差大?：樣本取材后需立即分裝，-20℃或-70℃凍存，?絕對避免反復(fù)凍融?;當天檢測的樣本4℃暫存，長期保存需添加足量蛋白酶抑制劑。

　　血清/血漿樣本出現(xiàn)假陽性?：樣本分離不凈、殘留纖維蛋白或溶血會直接干擾結(jié)果，采血后需靜置1~2小時，3000rpm離心15分鐘再取上清檢測。

　　標準曲線異常問題

　　標準曲線A450值遠低于說明書示例?：大概率是標準品溶解操作不規(guī)范，必須用試劑盒自帶的標準稀釋劑復(fù)溶，冰上靜置5~10分鐘充分混勻，禁止用超純水直接溶解。

　　標準曲線線性差、R2不足0.98?：倍比稀釋時蛋白吸附在普通EP管壁上，需使用硅化EP管操作;若出現(xiàn)奇異點，改用四參數(shù)曲線擬合替代簡單線性擬合。

　　標準品反復(fù)凍融后失效?：復(fù)溶后的標準品需按單次使用量分裝，-20℃凍存，每次實驗取1支新的使用，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致蛋白降解。

　　操作環(huán)節(jié)高頻問題

　　洗板后背景異常偏高?：洗板時洗液溢出孔外，高濃度孔污染空白孔是最常見原因;手工洗板甩板動作要干脆迅速，用干凈濾紙拍干，禁止用衛(wèi)生紙擦拭孔底。

　　整板幾乎無顯色(白板)?：優(yōu)先排查是否漏加酶結(jié)合物、TMB底物是否失活，可單獨取少量酶液加入TMB，若不顯色直接更換底物試劑。

　　實驗重復(fù)性差、孔間CV值超標?：移液器需定期校準，加樣時槍頭不要貼壁，避免液體掛在孔壁非包被區(qū);加樣順序從低濃度到高濃度，每個濃度更換新吸頭。

　　孵育后孔內(nèi)液體蒸發(fā)嚴重?：必須使用全新封板膜密封板孔，孵育箱溫度穩(wěn)定在37℃，禁止頻繁開箱，避免局部溫度不均導(dǎo)致液體蒸發(fā)。

　　結(jié)果異常類問題

　　樣本檢測值低于空白孔?：低豐度靶標接近試劑盒檢出限會出現(xiàn)該現(xiàn)象，大量樣本出現(xiàn)該情況是基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致，可將樣本適度稀釋，或用含10%~50%同源血清的PBS配制校正曲線修正。

　　全板背景值過高?：洗板不凈、酶結(jié)合物被污染、封閉時間不足是三大主因;可增加2次洗板次數(shù)，延長封閉時間至1.5小時，避免不同批次試劑混用。

　　顯色后顏色深淺不均?：洗板完成后需立即加入TMB底物，全程避光操作，從加第一孔開始精確計時，保證所有孔的顯色時間一致。

　　試劑耗材類特殊問題

　　試劑盒內(nèi)鏈霉親和素-HRP用完能否單獨補購?：原廠同批次的偶聯(lián)物不單獨售賣，可選購?fù)墑eELISA鏈霉親和素-HRP，但必須重新預(yù)實驗確定最佳稀釋比例，不能直接沿用原說明書參數(shù)。

　　無緩沖液的抗體對試劑盒如何運行?：需單獨購買配套的緩沖液試劑盒，其中5X檢測緩沖液可同時完成封閉、標準品和樣本稀釋的雙重作用，不能用普通PBS替代。

　　注：以上科研產(chǎn)品資料供參考!

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