Elisa實驗：酶聯(lián)免疫吸附測定類型與操作步驟

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）是將抗原抗體特異性反應與酶的高效催化作用結(jié)合的高靈敏度免疫檢測技術(shù)，目前已廣泛應用于醫(yī)學診斷、生物科研、食品檢測等多個領域。本生BUNSEN試劑盒

一、ELISA的測定類型

間接法?

原理?：先在固相載體上包被已知抗原，加入待檢樣本中的抗體后，再加入酶標記的二抗進行結(jié)合，最終通過顯色反應判定結(jié)果。

適用場景?：主要用于檢測樣本中的特異性抗體，比如HIV抗體篩查、疫苗免疫效價評估等場景。

特點?：通用性強，一種酶標二抗可適配多種一抗檢測，成本較低。

雙抗體夾心法?

原理?：使用一對配對的捕獲抗體和檢測抗體，將目標抗原夾在中間形成“抗體~抗原~抗體”的三明治結(jié)構(gòu)，再通過后續(xù)顯色完成定量。

適用場景?：適合檢測具有2個以上抗原表位的大分子蛋白，比如細胞因子、腫瘤標志物等微量物質(zhì)。

特點?：靈敏度高、特異性強，是目前應用的定量檢測類型。

競爭法?

原理?：樣本中的待測抗原和預先標記的已知抗原，競爭性結(jié)合固相載體上的有限抗體，最終顯色信號越弱代表樣本中目標抗原濃度越高。

適用場景?：專門用于檢測小分子抗原或半抗原，比如激素、獸藥殘留等無法形成雙抗體夾心的物質(zhì)。

直接法?

原理?：將酶直接標記在一抗上，直接與包被的抗原結(jié)合后顯色，操作流程更短。

適用場景?：多用于重組蛋白活性驗證，目前常規(guī)檢測中使用占比較低。

二、ELISA通用標準操作步驟

包被?

將捕獲抗體或抗原用包被液稀釋至1——10μg/mL的工作濃度，每孔加入100μL，4℃過夜孵育12——16小時，或37℃孵育1——2小時，讓目標蛋白充分吸附在96孔板表面。

封閉?

每孔加入200——300μL的封閉液（1%——5% BSA或5%脫脂牛奶），室溫孵育1——2小時，封閉固相載體上未結(jié)合蛋白的空白位點，避免后續(xù)步驟出現(xiàn)非特異性吸附。

加樣孵育?

分別加入梯度濃度的標準品和待測樣本，每孔100μL，37℃條件下孵育1——2小時，讓樣本中的目標分子與包被物充分發(fā)生特異性結(jié)合。

洗滌?

倒掉孔內(nèi)液體，每孔加入300μL PBST洗滌液，靜置30秒后甩掉液體并在吸水紙上拍干，重復3——5次，洗去所有未結(jié)合的游離物質(zhì)。

加酶標抗體?

每孔加入100μL酶標記的檢測抗體或二抗，37℃孵育30分鐘——1小時，完成結(jié)合后再次重復3——5次洗滌操作，去除未結(jié)合的酶標抗體。

顯色與終止?

每孔加入100μL TMB底物溶液，室溫避光顯色15——30分鐘，觀察最高濃度標準品孔變?yōu)樯钏{色后，每孔加入50μL 2M硫酸終止液，此時藍色反應液會變?yōu)榉€(wěn)定的黃色。

讀數(shù)與結(jié)果分析?

加入終止液后的15——30分鐘內(nèi)，使用酶標儀在450nm波長下讀取各孔的吸光度（OD值），通過標準品的濃度和對應OD值繪制標準曲線，最終計算出待測樣本中目標物質(zhì)的實際濃度。

三、關(guān)鍵操作注意事項

洗滌操作必須充分，次數(shù)不足會導致背景值偏高，洗滌過度則會造成特異性信號減弱，需嚴格按照試劑盒說明書要求執(zhí)行。

所有加樣步驟必須更換新的吸頭，避免樣本間交叉污染，試劑從冰箱取出后需恢復至室溫再使用，樣本禁止反復凍融。

實驗必須同步設置陽性對照、陰性對照和空白對照，待測樣本建議設置復孔，保證最終結(jié)果的準確性。

TMB底物溶液對光敏感，需避光保存和使用，顯色過程中需動態(tài)觀察顏色變化，精準把控終止時機。

注：以上資料僅供參考，不作為實際數(shù)據(jù)，實驗需嚴格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。

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