穩(wěn)定同位素組成常被用于追蹤物質(zhì)來源和反應(yīng)過程。但用傳統(tǒng)的IRMS分析方法，我們得到的 δ¹³C值，通常代表的是分子中所有碳原子的 “同位素平均值” 。
那么問題來了：
兩個(gè) δ¹³C 值相同的分子，就代表它們擁有相同的同位素特征嗎？
答案是否定的。
2023 年，Weiss 等人在 “International Journal of Mass Spectrometry”發(fā)表研究，利用 ESI-Orbitrap IRMS技術(shù)對丙氨酸分子內(nèi)部的碳同位素進(jìn)行分析，將傳統(tǒng)的“一個(gè)分子、一個(gè) δ¹³C” ，進(jìn)一步拓展至分子內(nèi)特異位點(diǎn)同位素分析(Position-Specific Isotope Analysis，PSIA)。
今天我們帶著4個(gè)科學(xué)問題一起來解讀這篇文章。
問題一：
為什么要關(guān)注分子內(nèi)不同位置的同位素值？
已有研究發(fā)現(xiàn)，不同形成路徑的丙氨酸的不同碳位點(diǎn) δ¹³C 特征完全不同。
丙氨酸的三個(gè)碳可以分別看作：
(點(diǎn)擊查看大圖)
研究顯示，通過 Strecker 反應(yīng)(非生物合成)的丙氨酸，其 C1 位相對于 C2+C3 明顯貧化 ¹³C；而由光合生物合成的丙氨酸，C1 通常相對于 C2+C3 更富集 ¹³C。
這意味著，同位素信息不僅存在于“這個(gè)分子的 δ¹³C 是多少”，還存在于“¹³C 分布在分子的什么位置”。
不同碳源、不同合成途徑以及不同反應(yīng)機(jī)制，都可能在分子內(nèi)部留下獨(dú)特的同位素“指紋”。
圖1. a圖顯示不同形成途徑的丙氨酸在 C1 、 C2和C3 位點(diǎn)呈現(xiàn)不同的同位素特征。b圖為生物合成法與Strecker 非生物合成丙氨酸的兩種路徑。數(shù)據(jù)引自論文所引用的既往研究。(點(diǎn)擊查看大圖)
問題二:
怎樣才能知道丙氨酸不同碳位點(diǎn)的13C值？
Orbitrap 提供了一種巧妙的思路：
先測完整分子，再通過可控碎裂“減掉”一部分分子結(jié)構(gòu)。
研究中，丙氨酸首先通過 ESI 形成完整分子離子。針對位置特異性分析，研究人員選擇 M+1 同位素體，并將其通過 HCD 高能碰撞解離技術(shù)進(jìn)行可控碎裂。
在 80 NCE 碰撞能量下，丙氨酸產(chǎn)生一個(gè)主要的 m/z 44 特征碎片(C?H?N?)。這個(gè)碎片有一個(gè)非常重要的特點(diǎn)：
C1 羧基碳在碎裂過程中易被脫除，而 C2 和 C3 被保留在 m/z 44 碎片中。
于是就得到了兩組互補(bǔ)的信息：
完整丙氨酸 → C1 + C2 + C3
m/z 44 特征碎片 → C2 + C3
結(jié)合完整分子和碎片離子的同位素組成，即可進(jìn)一步獲得 C1 羧基碳的位置特異性 δ¹³C 信息。
圖2.a: ESI-Orbitrap-IRMS 對丙氨酸進(jìn)行 HCD 可控碎裂。C1 羧基在碎裂過程中脫除，形成保留 C2+C3 的 m/z 44 特征碎片；b: 傳統(tǒng) IRMS 進(jìn)行丙氨酸位點(diǎn)特異性分析，需要先借助化學(xué)反應(yīng)“拆分”碳位點(diǎn)：通過茚三酮反應(yīng)將 C1 轉(zhuǎn)化為 CO?，將 C2+C3 保留在乙醛中，再分別進(jìn)行同位素分析；若需進(jìn)一步區(qū)分 C2 與 C3，還需結(jié)合乙醛熱裂解及 GC-IRMS 分析。相比之下，ESI-Orbitrap 可直接利用 HCD 在質(zhì)譜內(nèi)部實(shí)現(xiàn)可控碎裂，為獲取位點(diǎn)特異性同位素信息提供了另一條技術(shù)路徑。(點(diǎn)擊查看大圖)
問題三：
怎么確認(rèn)碎片真的來自 C2+C3？
雖然可以利用ESI-Orbitrap技術(shù)對丙氨酸進(jìn)行 HCD 可控碎裂，但還有一個(gè)非常關(guān)鍵的問題是：
碎片中的原子，真的來自我們認(rèn)為的那些位置嗎？
如果碰撞過程中發(fā)生明顯的原子重排，即使獲得了漂亮的碎片峰，也可能無法準(zhǔn)確還原原始分子的位點(diǎn)信息。
為此，這篇文獻(xiàn)中，研究人員設(shè)計(jì)了不同位置的 ¹³C 標(biāo)記丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別在 C1、C2 和 C3 位點(diǎn)引入標(biāo)記的 ¹³C，并觀察碎裂后 ¹³C 的去向。
通過這些位置標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品，可以確認(rèn)原始分子中的不同碳原子最終進(jìn)入了哪些碎片，同時(shí)檢查 HCD 碎裂過程中是否存在顯著的碳原子重排。
研究結(jié)果支持：
m/z 44 碎片確實(shí)保留 C2 和 C3，而 C1 在碎裂過程中被脫除；同時(shí)沒有觀察到影響該分析的顯著碳原子重排。
問題四：
Orbitrap結(jié)果準(zhǔn)不準(zhǔn)？
研究人員利用 EA-IRMS、GC-IRMS 以及 GC-Py-GC-C-IRMS 等成熟技術(shù)，對 Orbitrap 獲得的結(jié)果進(jìn)行了獨(dú)立驗(yàn)證。
結(jié)果顯示，ESI-Orbitrap-MS 與傳統(tǒng) IRMS 方法獲得的結(jié)果具有良好一致性。
ESI-Orbitrap-MS 的RMSE（均方根誤差，用來衡量一組測量值與參考值之間總體偏差有多大）： 整體分子 δ¹³C 的 RMSE 約為 1.04‰，C2+C3 和 C1 位點(diǎn)分別約為 1.25‰ 和 3.68‰。整體分子 δ¹³C 測量的重復(fù)性(SE)為 0.2–0.9‰，位點(diǎn)的測量重復(fù)性(SE)優(yōu)于 1.5‰。
圖3. ESI-Orbitrap-IRMS 與傳統(tǒng) IRMS 方法的結(jié)果比較。上圖：橫坐標(biāo) = ESI-Orbitrap 測出來的結(jié)果；縱坐標(biāo) = 傳統(tǒng) IRMS 方法得到的結(jié)果。點(diǎn)越接近 1:1 對角線，說明兩種方法越一致。下圖：Residuals，殘差圖，即Orbitrap 結(jié)果與傳統(tǒng) IRMS 結(jié)果之間差了多少。點(diǎn)越靠近橫向的0 線，說明兩種方法越一致。(點(diǎn)擊查看大圖)
除了位點(diǎn)分辨能力，這項(xiàng)研究也展示了 ESI-Orbitrap IRMS方法在樣品量需求和分析流程方面的特點(diǎn)。僅需5 μg 丙氨酸即可獲得完整分子及特異位點(diǎn)結(jié)果的三次重復(fù)測量。同時(shí)，該方法無需對丙氨酸進(jìn)行衍生化。對于復(fù)雜樣品體系，未來ESI-Orbitrap IRMS可與 HPLC 在線分離技術(shù)相結(jié)合，為復(fù)雜基質(zhì)中的目標(biāo)化合物同位素分析提供進(jìn)一步拓展空間。
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整個(gè)分析平臺(tái)包括：
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參考文獻(xiàn)：
Weiss G M, Sessions A L, Julien M, et al. Analysis of intramolecular carbon isotope distributions in alanine by electrospray ionization Orbitrap mass spectrometry[J]. International Journal of Mass Spectrometry, 2023, 493: 117128.
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