當(dāng)組織被解離成單個細(xì)胞，我們獲得了細(xì)胞身份，卻丟失了它原本所在的位置。如今，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)正嘗試把這塊“拼圖”重新找回來。從“認(rèn)識細(xì)胞”到“理解細(xì)胞”，我們還缺少什么？發(fā)表于Nature Communications的最新研究《EasySCP unveils extensive liver zonation at single-cell proteomics resolution》，正是圍繞這一問題，并基于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)徐徐展開。
單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)雖然已經(jīng)取得了快速發(fā)展，但真正進(jìn)入更多實驗室仍然面臨一個現(xiàn)實挑戰(zhàn)——樣品制備。相比傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)實驗，單細(xì)胞樣品量極低，對每一步操作都提出了更高要求。研究人員不僅需要完成單細(xì)胞分選，還要在納升級甚至更小體積內(nèi)完成細(xì)胞裂解、蛋白酶解和樣品處理。任何一次液體轉(zhuǎn)移、任何一次吸附損失，都可能導(dǎo)致最終檢測失敗。因此，目前不少單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)流程仍然依賴專用芯片、微流控系統(tǒng)或復(fù)雜的自動化設(shè)備，雖然檢測能力不斷提高，但實驗門檻也隨之增加。
如果一種技術(shù)能夠做到：不依賴復(fù)雜微流控平臺，使用常規(guī)實驗室即可完成樣品制備；且盡可能減少樣品損失的同時保持較高的檢測深度和良好的重復(fù)性，那么，它就有機(jī)會真正推動單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)走向更廣泛的應(yīng)用。本文要介紹的EasySCP正是在這樣的背景下誕生。
EasySCP：把復(fù)雜流程，變成“一鍋完成”
EasySCP(Easy Single-Cell Proteomics)是重新設(shè)計了整個單細(xì)胞樣品制備流程。研究團(tuán)隊采用了目前實驗室普遍具備的流式細(xì)胞分選(FACS)技術(shù)，將單個細(xì)胞直接分選至預(yù)先完成試劑鋪板的384孔板中。具體來說，即將蛋白質(zhì)組學(xué)裂解細(xì)胞及酶切等操作所需的質(zhì)譜及蛋白酶兼容的去垢劑、蛋白酶以及質(zhì)譜可揮發(fā)的緩沖鹽預(yù)先鋪板，而后FACS技術(shù)基于細(xì)胞大小尺寸、熒光標(biāo)記等將細(xì)胞分選入孔內(nèi)，與預(yù)先鋪板的SuperMix裂解液進(jìn)行反應(yīng)，無需反復(fù)轉(zhuǎn)移樣品。整個流程遵循類似于“One-pot(一鍋法)”設(shè)計理念，使所有關(guān)鍵反應(yīng)均在同一反應(yīng)體系中完成，大幅減少了超微量樣品在操作過程中的損失。與此同時，研究團(tuán)隊利用PCR儀熱蓋維持穩(wěn)定溫度，在保證酶解效率的同時有效降低反應(yīng)液蒸發(fā)，使整個實驗流程更加穩(wěn)定，也更容易在不同實驗室之間實現(xiàn)重復(fù)。相比需要復(fù)雜微流控裝置或定制芯片的平臺，這種設(shè)計更加貼近日常實驗室的操作習(xí)慣，也降低了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用門檻。更重要的是，EasySCP并沒有因為流程簡化而犧牲檢測性能。作者在接下來的實驗結(jié)果證明，這套流程不僅操作更加簡潔，而且依然能夠?qū)崿F(xiàn)高深度、高重復(fù)性的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組檢測，為后續(xù)開展復(fù)雜組織和空間生物學(xué)研究奠定了可靠基礎(chǔ)。
圖1|EasySCP采用384孔板結(jié)合FACS分選和One-pot樣品制備策略，大幅降低單細(xì)胞樣品處理復(fù)雜度。
從"能做"到"做好"：EasySCP如何證明自己的實力？
一種新的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)方法，要真正獲得研究人員認(rèn)可，僅有簡化的實驗流程還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。我想，對于科研工作者而言，更關(guān)心的是三個問題：
它測得夠深嗎？
數(shù)據(jù)穩(wěn)定嗎？
面對真實復(fù)雜樣本還能不能保持同樣的表現(xiàn)？
圍繞這三個問題，研究團(tuán)隊設(shè)計了一系列層層遞進(jìn)的驗證實驗。從標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系到復(fù)雜腫瘤組織，再到最終的肝臟空間重建，每一步都在回答同一個問題——EasySCP究竟是否具備成為一種通用單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)方法的潛力？
01 在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞中，它能測到多少蛋白？
任何一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，首先都需要在標(biāo)準(zhǔn)樣本中驗證檢測性能。研究團(tuán)隊選擇了人胚腎細(xì)胞系 HEK293 作為模型，對EasySCP流程進(jìn)行了系統(tǒng)評估。依托EasySCP樣品制備流程，在24分鐘液相梯度條件下，即可實現(xiàn)超過7200種蛋白和50000余條肽段的鑒定深度，技術(shù)重復(fù)之間也表現(xiàn)出良好的一致性。如此高的覆蓋深度，說明EasySCP不僅能夠滿足單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)對靈敏度的要求，同時也具備穩(wěn)定可靠的定量能力。
圖2|EasySCP在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞模型中實現(xiàn)高深度蛋白鑒定，并保持優(yōu)異的技術(shù)重復(fù)性。
02 真正進(jìn)入單細(xì)胞，性能還能保持嗎？
標(biāo)準(zhǔn)樣本只能說明方法可行，而真正具有挑戰(zhàn)性的，是單個細(xì)胞。單細(xì)胞樣本意味著極低的蛋白起始量，也意味著任何微小的實驗誤差都會被無限放大。因此，研究團(tuán)隊進(jìn)一步優(yōu)化了反應(yīng)體系體積和酶解條件，對真實單細(xì)胞進(jìn)行了檢測。
結(jié)果顯示，在單個細(xì)胞中，EasySCP依然能夠穩(wěn)定鑒定4200余種蛋白；當(dāng)樣本量增加至20個細(xì)胞時，可鑒定蛋白數(shù)量進(jìn)一步提升至6500種以上(采用MBR分析策略)。與此同時，空白對照僅檢測到少量蛋白信號，說明整個實驗體系具有較低背景干擾，數(shù)據(jù)來源可靠，而非環(huán)境污染或交叉污染造成的假陽性結(jié)果，
這說明EasySCP在靈敏度和背景控制之間取得了良好的平衡。
面對復(fù)雜組織，它還能保持穩(wěn)定表現(xiàn)嗎？
實驗室培養(yǎng)細(xì)胞雖然便于評價技術(shù)性能，但距離真實生物學(xué)問題還有一定距離。真正復(fù)雜的是組織樣本。在組織中，不同類型細(xì)胞混雜共存，細(xì)胞大小、蛋白豐度和代謝狀態(tài)都存在顯著差異，這也是單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)最具挑戰(zhàn)性的應(yīng)用場景之一。
為了進(jìn)一步驗證EasySCP的適用范圍，研究團(tuán)隊將其應(yīng)用于MC38小鼠結(jié)直腸癌模型。實驗首先通過CD45標(biāo)記將腫瘤組織中的免疫細(xì)胞與非免疫細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，再分別開展單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果顯示，免疫細(xì)胞中可得到中位數(shù)3200+蛋白和12000+肽段鑒定，而非免疫細(xì)胞中則可得到3500+蛋白以及14000+肽段的鑒定；而且不同細(xì)胞群之間形成了清晰的蛋白表達(dá)譜差異。這說明，僅依據(jù)蛋白質(zhì)表達(dá)信息，就能夠準(zhǔn)確區(qū)分免疫細(xì)胞和腫瘤相關(guān)細(xì)胞，并呈現(xiàn)出符合生物學(xué)規(guī)律的功能富集結(jié)果。
這一結(jié)果說明，EasySCP不僅適用于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系，同樣能夠勝任復(fù)雜組織微環(huán)境中的單細(xì)胞分析，為后續(xù)研究腫瘤免疫、組織異質(zhì)性等問題提供了可靠工具。
圖3|EasySCP不僅適用于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞，也能夠穩(wěn)定應(yīng)用于真實單細(xì)胞及復(fù)雜腫瘤組織
真正的突破，并不只是"測得更多"
這項工作它讓研究團(tuán)隊首次具備了在大規(guī)模單細(xì)胞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，重新思考一個長期困擾空間生物學(xué)的問題：
如果組織已經(jīng)被完全解離，我們還能不能僅憑蛋白質(zhì)表達(dá)譜，推斷每一個細(xì)胞原本位于組織中的哪個位置？
對于大多數(shù)器官來說，這或許只是一個有趣的科學(xué)設(shè)想。但對于具有明確空間分區(qū)特征的肝臟而言，這個問題意味著另一種可能——蛋白質(zhì)表達(dá)是否能夠成為重建組織空間結(jié)構(gòu)的新依據(jù)？正是在這一思路推動下，EasySCP開始從一項樣品制備技術(shù)，邁向了這篇論文真正的科學(xué)核心：單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分辨率下的肝臟空間重建。
從"看到蛋白"到"找回位置"：單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)如何重建肝臟空間圖譜？
當(dāng)組織已經(jīng)被完全解離，每一個細(xì)胞還能不能"記得"自己來自哪里？
過去，空間信息幾乎完全依賴組織切片。無論是空間轉(zhuǎn)錄組、空間蛋白組，還是激光顯微切割(LCM)結(jié)合質(zhì)譜分析，都需要在組織保持完整結(jié)構(gòu)的前提下進(jìn)行檢測。一旦組織被消化、細(xì)胞被分離，原有的空間關(guān)系便隨之消失。因此，在傳統(tǒng)單細(xì)胞研究中，我們通常能夠回答兩個問題：
這是什么細(xì)胞？
它表達(dá)了哪些分子？
卻很難回答第三個問題：它原本位于組織中的哪里？
而對于肝臟而言，這恰恰是理解其生物學(xué)功能最重要的信息之一。
肝臟為什么如此依賴"空間"？
很多人認(rèn)為，肝細(xì)胞都是一樣的。事實上并非如此。從門靜脈(Portal Vein，PV)到中央靜脈(Central Vein，CV)，肝細(xì)胞形成了一條連續(xù)變化的功能梯度，這種現(xiàn)象被稱為肝臟空間分區(qū)（Liver Zonation）。可以把它理解成一條不斷變化的"功能坐標(biāo)軸"。位于門靜脈附近的肝細(xì)胞，更傾向于承擔(dān)基礎(chǔ)代謝任務(wù)，例如糖異生、尿素循環(huán)以及脂肪酸氧化等過程；而靠近中央靜脈的肝細(xì)胞，則主要負(fù)責(zé)糖酵解、脂質(zhì)合成以及藥物代謝等功能。雖然這些細(xì)胞在顯微鏡下看起來幾乎沒有區(qū)別，但它們表達(dá)的蛋白質(zhì)和執(zhí)行的生物學(xué)功能卻截然不同。因此，對于肝臟來說，空間位置本身就是功能的一部分。
研究團(tuán)隊利用EasySCP分析了608個小鼠單個肝細(xì)胞，并結(jié)合流式細(xì)胞分選獲得具有不同空間來源的細(xì)胞群體。即使不依賴組織切片，僅根據(jù)單細(xì)胞蛋白表達(dá)譜，不同區(qū)域來源的肝細(xì)胞依然能夠形成連續(xù)而穩(wěn)定的空間分布。研究人員進(jìn)一步對5267個可定量蛋白進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其中約三分之二的蛋白呈現(xiàn)出明顯的空間表達(dá)梯度。大量蛋白的表達(dá)水平會隨著細(xì)胞從門靜脈區(qū)域向中央靜脈區(qū)域移動而發(fā)生規(guī)律性變化，而這種變化并非隨機(jī)，而是與肝臟已知的功能分區(qū)高度一致。這些結(jié)果與既往基于空間蛋白組學(xué)和組織切片獲得的認(rèn)識相互印證，也進(jìn)一步證明了EasySCP重建空間信息的可靠性。
這一結(jié)果說明，蛋白質(zhì)表達(dá)不僅記錄了細(xì)胞正在執(zhí)行什么功能，也保留了細(xì)胞所處空間環(huán)境的信息。
圖 4|第一次，在單細(xì)胞蛋白組水平"看見"肝臟空間分區(qū)(點擊查看大圖)
圖5|對于肝臟而言，"位置"決定了細(xì)胞承擔(dān)的生物學(xué)功能，且超過三分之二蛋白具有空間表達(dá)梯度。(點擊查看大圖)
HSS：給每一個細(xì)胞一個"空間身份證"
基于這些具有空間特征的蛋白標(biāo)志物，研究團(tuán)隊進(jìn)一步建立了Hepatocyte Spatial Status(HSS)評分體系。可以把HSS理解為一種"空間定位算法"。它并不是通過觀察細(xì)胞的位置來判斷其屬于哪個區(qū)域，而是根據(jù)單細(xì)胞蛋白表達(dá)譜，為每一個細(xì)胞計算一個空間得分。這一得分反映了細(xì)胞更接近門靜脈區(qū)域、中央靜脈區(qū)域，還是處于兩者之間的連續(xù)過渡狀態(tài)。這意味著，即使組織已經(jīng)完全解離，研究人員依然能夠依據(jù)蛋白質(zhì)表達(dá)信息，推斷細(xì)胞原本所在的位置。某種意義上說，每一個細(xì)胞都擁有了一張能夠"證明自己來自哪里"的空間身份證。這種能力，為傳統(tǒng)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)賦予了新的維度。
研究團(tuán)隊進(jìn)一步將HSS應(yīng)用于不同來源的數(shù)據(jù)集，包括單細(xì)胞RNA測序、空間轉(zhuǎn)錄組以及公開數(shù)據(jù)庫。結(jié)果顯示，這套基于蛋白質(zhì)建立的空間參考框架具有良好的跨平臺兼容性，可以作為不同組學(xué)之間共同的"空間語言"，幫助不同數(shù)據(jù)類型建立統(tǒng)一的空間坐標(biāo)體系。這意味著：
• 單細(xì)胞RNA數(shù)據(jù)有望借助蛋白質(zhì)標(biāo)志物重新獲得空間定位信息；
• 不同實驗批次之間能夠建立統(tǒng)一的空間參考，提高數(shù)據(jù)整合能力；
• 不同疾病模型、不同物種之間，也可能利用相同框架比較細(xì)胞空間狀態(tài)的變化。
對于空間生物學(xué)而言，這種跨平臺整合能力具有重要意義。它意味著，未來研究者獲得空間信息，不再只有依賴組織切片這一種路徑，而是有望直接從高質(zhì)量的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中重建組織空間圖譜。
總結(jié)：
本研究亮點：
• 建立了基于384孔板的一鍋法單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)流程EasySCP；
• 在真實單細(xì)胞中實現(xiàn)高深度、高重復(fù)性的蛋白質(zhì)組檢測；
• 首次在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分辨率下重建肝臟空間分區(qū)；
• 提出Hepatocyte Spatial Status(HSS)空間評分體系；
• 證明蛋白質(zhì)表達(dá)可作為細(xì)胞空間定位的重要信息來源。
參考文獻(xiàn)：
Hao B, et al. EasySCP unveils extensive liver zonation at single-cell proteomics resolution. Nature Communications, 2026.
關(guān)鍵詞：Single-cell Proteomics|EasySCP|Liver Zonation|Orbitrap Astral™|Spatial Biology
研究團(tuán)隊介紹
本研究由鄭州大學(xué)天健先進(jìn)生物醫(yī)學(xué)實驗室聯(lián)合以色列魏茨曼科學(xué)研究所（Weizmann Institute of Science）、北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院等單位共同完成，是我國科研團(tuán)隊與國際研究機(jī)構(gòu)在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域開展合作取得的重要成果。
第一作者及通訊作者 | 郝兵兵 副研究員
郝兵兵博士(Bingbing Hao)現(xiàn)任鄭州大學(xué)天健先進(jìn)生物醫(yī)學(xué)實驗室副研究員，長期從事單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)方法開發(fā)及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究，是EasySCP技術(shù)的主要研發(fā)者之一。
通訊作者 | 李保國 教授
李保國教授現(xiàn)任鄭州大學(xué)天健先進(jìn)生物醫(yī)學(xué)實驗室相關(guān)研究團(tuán)隊負(fù)責(zé)人，長期致力于代謝性疾病、蛋白質(zhì)組學(xué)及單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)的研究。
通訊作者 | Ido Amit 教授
Ido Amit教授現(xiàn)任以色列魏茨曼科學(xué)研究所(Weizmann Institute of Science)免疫學(xué)系教授，是國際單細(xì)胞組學(xué)領(lǐng)域的重要學(xué)者之一。
通訊作者 | 秦國臣 研究員
秦國臣研究員現(xiàn)任北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院質(zhì)譜分析(蛋白質(zhì)組與代謝組)平臺主任、作物質(zhì)譜分析與分子育種課題組負(fù)責(zé)人，長期從事高分辨率質(zhì)譜分析技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)方法開發(fā)及其生物學(xué)應(yīng)用研究。
寫在最后：
從"測得更多"到"看得更深"：高性能質(zhì)譜平臺如何推動單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)邁向空間生物學(xué)？
如果把EasySCP比作一套更加高效、更加普適的單細(xì)胞樣品制備流程，那么真正支撐這項研究完成的另一塊基石，則來自高性能質(zhì)譜分析平臺。
事實上，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，一直受到兩個關(guān)鍵因素的共同推動。一方面，是樣品制備流程不斷優(yōu)化，使越來越少的蛋白損失在實驗過程中；另一方面，則是質(zhì)譜儀器不斷突破檢測靈敏度、掃描速度和定量穩(wěn)定性的邊界，讓研究者能夠從極其有限的樣本中獲取更多、更可靠的信息。兩者缺一不可。
EasySCP能夠在單細(xì)胞水平獲得數(shù)千種蛋白的穩(wěn)定鑒定，并進(jìn)一步開展空間重建分析，正是建立在樣品制備與質(zhì)譜檢測協(xié)同優(yōu)化的基礎(chǔ)之上。一個哺乳動物細(xì)胞內(nèi)蛋白總量通常只有皮克(pg)級別，相比常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)實驗，起始樣品量降低了數(shù)百萬倍。這意味著，每一次離子利用效率的提升、每一次掃描速度的優(yōu)化、每一次定量穩(wěn)定性的改善，都可能直接影響最終能夠鑒定到多少蛋白，以及這些蛋白是否能夠真實反映細(xì)胞狀態(tài)。
本研究中，EasySCP流程獲得的樣品最終通過 Thermo Scientific™ Orbitrap Astral™ 質(zhì)譜平臺完成采集，并結(jié)合 Vanquish™ Neo 納升級液相系統(tǒng)進(jìn)行分析。對于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)而言，這套平臺的價值不僅體現(xiàn)在更高的蛋白鑒定數(shù)量，更重要的是能夠在極低樣品起始量條件下保持高靈敏度、高掃描速度和穩(wěn)定的定量表現(xiàn)。從這個角度來看，Orbitrap Astral™不僅是一臺性能優(yōu)異的質(zhì)譜儀，更是推動單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)從"深度檢測"走向"空間解析"的重要技術(shù)支撐。
展望：從"測得更深"邁向"測得更多"
隨著越來越多研究開始關(guān)注組織異質(zhì)性、疾病進(jìn)程以及細(xì)胞命運(yùn)演變等復(fù)雜生物學(xué)問題，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)正在面臨新的挑戰(zhàn)——如何進(jìn)一步提升實驗通量。
目前，大多數(shù)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程仍采用單細(xì)胞逐個上機(jī)分析的模式。盡管近年來儀器靈敏度和掃描速度不斷提升，但在開展數(shù)千甚至數(shù)萬個細(xì)胞的大規(guī)模研究時，質(zhì)譜采集時間依然是影響實驗效率的重要因素。因此，多重同位素標(biāo)記(Multiplexing)正逐漸成為單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的重要發(fā)展方向。
其中，基于 Tandem Mass Tag(TMT) 的多重標(biāo)記策略，在一次LC-MS/MS采集中同步完成多個樣本的定量，從而顯著提升樣本分析效率，并有效降低批次效應(yīng)。并且隨著標(biāo)記化學(xué)和質(zhì)譜檢測能力的不斷提升，更高plex數(shù)的TMT試劑正在進(jìn)一步拓展單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的通量邊界。如新一代 TMT 32plex &35plex有望在保持高定量準(zhǔn)確性的同時，實現(xiàn)更多單細(xì)胞樣本的同步分析，為大規(guī)模細(xì)胞圖譜繪制、疾病隊列研究以及空間生物學(xué)研究提供更高效的數(shù)據(jù)獲取能力。
目前，賽默飛也正在開發(fā)基于TMT標(biāo)記的高通量單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程，希望結(jié)合高效樣品制備策略與新一代高plex多重標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)一步提升單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測通量和實驗效率，助力更大規(guī)模、更高分辨率的生物學(xué)研究。
從EasySCP降低單細(xì)胞樣品制備門檻，到Orbitrap Astral™&Orbitrap Astral Zoom平臺持續(xù)提升檢測深度，再到TMT等高plex多重標(biāo)記策略不斷突破實驗通量，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)正逐步構(gòu)建起覆蓋樣品制備—高靈敏度檢測—高通量定量的完整技術(shù)體系。隨著這些關(guān)鍵技術(shù)不斷成熟，研究者將能夠以前所未有的深度和規(guī)模解析復(fù)雜組織中的細(xì)胞異質(zhì)性，為空間生物學(xué)、疾病機(jī)制研究以及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)帶來更多可能。
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