穩(wěn)定同位素分析已廣泛應(yīng)用于代謝研究、生物合成、環(huán)境科學(xué)及食品真實性等領(lǐng)域。然而，傳統(tǒng)同位素比值分析通常只能獲得化合物整體的同位素組成(Bulk Isotope Ratio)，難以進(jìn)一步解析分子內(nèi)部不同原子位點的同位素分布。
隨著研究不斷深入，科研人員越來越關(guān)注分子內(nèi)部同位素信息。例如，在代謝途徑研究中，僅知道谷氨酸整體的δ¹³C值已難以滿足研究需求，更希望進(jìn)一步了解不同碳位點的同位素組成，從而解析碳流向、生物合成路徑及分子來源。這正是特異位點同位素分析(Position-Specific Isotope Analysis，PSIA)的重要價值所在。
基于新一代 Thermo Scientific™ Orbitrap™ IRMS 平臺，我們建立了一套適用于氨基酸的特異位點同位素分析工作流程，并以谷氨酸為例進(jìn)行了分析，為小分子同位素分析提供了一種新的研究思路。
一體化工作流程，讓同位素分析更高效
Orbitrap IRMS 基于 Orbitrap Isora™ 高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，將樣品引入、數(shù)據(jù)采集、校準(zhǔn)及數(shù)據(jù)處理整合為一體化工作流程。
整個分析平臺包括：
• Thermo Scientific Orbitrap Isora MS
• Thermo Scientific Vanquish™ Duo UHPLC 自動進(jìn)樣系統(tǒng)
• Thermo Scientific Isotope Discoverer™ 數(shù)據(jù)處理軟件
從樣品自動進(jìn)樣、方法開發(fā)、數(shù)據(jù)采集，到數(shù)據(jù)校準(zhǔn)、處理及報告生成，實現(xiàn)完整的同位素分析流程。
(點擊查看大圖)
其中，Vanquish Duo 采用樣品/標(biāo)準(zhǔn)交替進(jìn)樣(Sample/Reference Bracketing)的策略，實現(xiàn)樣品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的自動交替分析，可有效校正長時間測定過程中的儀器漂移，提高δ值計算的穩(wěn)定性和重復(fù)性。與此同時，Isotope Discoverer 軟件集成了同位素比值計算、校準(zhǔn)及結(jié)果可視化功能，大幅簡化了數(shù)據(jù)處理流程。
一次分析，獲得多維度同位素信息
Orbitrap IRMS 的突出優(yōu)勢在于，通過同一套工作流程即可獲得多個維度的同位素信息，而無需分別建立不同分析方法。
整個分析包括兩個互補的實驗：
1 完整分子同位素分析
樣品經(jīng)ESI電離后生成完整的谷氨酸分子離子([M+H]?)。結(jié)合先進(jìn)四極桿技術(shù)(AQT)和 Orbitrap 高分辨率準(zhǔn)確質(zhì)量(HRAM)檢測，可有效分離目標(biāo)同位素體與干擾離子，并直接獲得完整分子的δ¹³C等整體同位素信息。實驗中，在120,000分辨率下可同時分辨多達(dá)六種谷氨酸同位素體，為高精度同位素分析提供了可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
圖1.谷氨酸 [M+H]+ 離子在 120,000 Orbitrap 分辨率下的典型質(zhì)譜圖。從同一谷氨酸采集數(shù)據(jù)中可分辨出多達(dá)六個谷氨酸同位素體比值，包括含 ¹³C、¹?N 和 ²H 的同位素體。(點擊查看大圖)
2 特異位點同位素分析
Orbitrap™ IRMS 的另一項優(yōu)勢在于可利用高能碰撞解離(HCD)實現(xiàn)可控碎裂。
谷氨酸分子經(jīng)MS²裂解后產(chǎn)生特征性亞銨離子(Immonium ion)，由于裂解過程中脫除了C1羧基，該碎片保留了C2–C5主鏈信息。結(jié)合高分辨率檢測，可有效分離²H與¹³C等質(zhì)量接近的同位素峰，進(jìn)一步獲得分子內(nèi)部不同位點的同位素組成。
圖2.谷氨酸在MS2模式下的質(zhì)譜掃描圖(70%碰撞能量)
(點擊查看大圖)
通過比較完整分子與碎片離子的同位素組成，可進(jìn)一步計算獲得：
• 整體 δ¹³C
• 整體 δ¹?N
• 整體 δ²H
• C2–C5 主鏈 δ¹³C
• C1 羧基 δ¹³C
真正實現(xiàn)從整體同位素分析向特異位點同位素分析的拓展。
圖3.分辨率設(shè)為 75,000 時兩種模式質(zhì)譜圖：A) 全掃描模式下完整谷氨酸離子 [M+H]+ B) MS2裂解模式下的亞銨離子。(點擊查看大圖)
高重復(fù)性驗證方法可靠性
為驗證方法的穩(wěn)定性，該工作流程在5臺不同的 Orbitrap Isora™ 質(zhì)譜儀上完成了8組獨立實驗。特異位點δ¹³C分析同樣表現(xiàn)出良好的重復(fù)性，證明該方法不僅能夠獲得整體同位素組成，還能夠穩(wěn)定、可靠地解析分子內(nèi)部不同碳位點的同位素信息。
為小分子同位素分析提供新的研究工具
谷氨酸只是這一分析方法的驗證案例，更重要的是展示了 Orbitrap IRMS 在特異位點同位素分析方面的潛力。
借助完整分子分析與可控裂解技術(shù)相結(jié)合，Orbitrap IRMS 將同位素分析從整體水平拓展至分子內(nèi)部，不僅能夠獲得更多結(jié)構(gòu)相關(guān)信息，還為解析代謝途徑、碳源貢獻(xiàn)、生物合成機制及分子來源提供了新的研究工具。
未來，該工作流程可進(jìn)一步拓展至氨基酸、代謝物、天然產(chǎn)物等更多小分子體系，在代謝組學(xué)、生物合成研究、食品真實性、環(huán)境科學(xué)及地球化學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)廣闊的應(yīng)用前景。
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