今天將要分享一篇客戶近期發(fā)表于 Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (JPBA) 的文章，該研究以治療性融合蛋白阿柏西普(Aflibercept)為模型，基于 Thermo Scientific™ Orbitrap™ Excedion™ Pro 高分辨質(zhì)譜平臺和EThcD(Electron Transfer/Higher-energy Collision Dissociation)碎裂技術(shù)，建立了一套用于糖基化和Asp異構(gòu)化深度表征的分析方案。研究結(jié)果充分展示了高分辨質(zhì)譜平臺在復雜生物藥結(jié)構(gòu)解析中的能力，也進一步體現(xiàn)了EThcD技術(shù)在糖肽和異構(gòu)化分析中的獨特優(yōu)勢。
糖基化是生物藥最重要的翻譯后修飾之一，直接影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、生物活性、藥代動力學以及免疫原性。隨著融合蛋白、雙抗和ADC等復雜生物藥的發(fā)展，如何同時實現(xiàn)糖基化、異構(gòu)化以及多種關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)的精準表征，已經(jīng)成為分析科學面臨的重要挑戰(zhàn)。
阿柏西普是一種高度復雜的融合蛋白，含有5個N-糖基化位點(圖1)以及多個潛在O-糖基化位點，同時還存在Asp異構(gòu)化、脫酰胺和氧化等多種翻譯后修飾。傳統(tǒng)糖鏈分析通常采用糖鏈釋放結(jié)合熒光標記的方法，雖然適用于總糖型分析，但無法獲得位點特異性的糖基化信息；而常規(guī)HCD碎裂在糖肽分析時往往優(yōu)先斷裂糖苷鍵，產(chǎn)生大量糖鏈碎片，卻難以獲得足夠的肽骨架信息用于糖基化位點確認。
圖1. 阿柏西普結(jié)構(gòu)示意圖
本研究采用Orbitrap Excedion Pro平臺進行數(shù)據(jù)采集，在120,000分辨率的Full MS和30,000分辨率的MS/MS條件下，實現(xiàn)了全梯度EThcD數(shù)據(jù)依賴性二級掃描。高分辨率、高掃描速度和高靈敏度的結(jié)合，使復雜糖蛋白樣品能夠在一次進樣中獲得高質(zhì)量MS/MS數(shù)據(jù)，為后續(xù)的序列覆蓋和修飾鑒定奠定了基礎(chǔ)。
研究結(jié)果顯示，無論采用Trypsin、LysC還是ArgC酶切方案，均能夠獲得100%的蛋白序列覆蓋率。對于糖基化程度高、結(jié)構(gòu)復雜的融合蛋白而言，這一結(jié)果具有重要意義，因為它意味著不僅能夠完成常規(guī)肽段鑒定，還能夠同步獲取完整的翻譯后修飾信息。
在糖基化分析方面，EThcD展現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。以N196位點糖肽為例，研究獲得了豐富的c/z離子系列，同時保留了完整糖鏈信息。前體離子質(zhì)量誤差僅為−1.78 ppm，主要碎片離子質(zhì)量誤差均小于6 ppm。高質(zhì)量精度不僅提高了鑒定可信度，也為糖鏈組成確認和位點定位提供了堅實依據(jù)(圖2)。
圖2. 肽段KN(196)STFVR （3+，m/z = 922.720， N-糖鏈 A2S1G1） 的 EThcD MS² 譜圖。三價前體離子的全譜圖及局部放大圖均顯示出豐富的診斷性 c/z 碎片離子（如 c?–c? 和 z?–z?）、氧鎓離子（oxonium ions） 以及保留部分糖鏈結(jié)構(gòu)的肽段碎片離子。這些碎片信息共同支持了肽段序列的準確鑒定和糖基化位點的精確定位。MS 和 MS/MS 譜圖均表現(xiàn)出優(yōu)異的質(zhì)量精度（< 6 ppm）和較高的信噪比。（點擊查看大圖）
更值得關(guān)注的是平臺表現(xiàn)出的檢測靈敏度。研究中成功鑒定了N68位點一個相對豐度僅為0.68%的A3S3F高唾液酸化糖型(圖3)。由于高度唾液酸化糖肽在正離子模式下通常電離效率較低，因此此類低豐度糖型往往難以獲得高質(zhì)量MS/MS數(shù)據(jù)。然而在Orbitrap Excedion Pro平臺上，研究人員仍然獲得了完整的c/z離子覆蓋和準確的糖基化位點信息，所有關(guān)鍵碎片離子的質(zhì)量誤差均小于6 ppm。這表明該平臺不僅能夠覆蓋高豐度糖型，也能夠勝任痕量糖型的深入表征。
圖3. 肽段 KGFIISN(68)ATYK（3+，m/z = 1417.591，N-糖鏈 A3S3F） 的 EThcD MS² 譜圖。該糖型的相對豐度僅為 0.68%。三價前體離子的全譜圖及局部放大圖均顯示出豐富的診斷性 c/z 碎片離子（如 c?–c?）、氧鎓離子（oxonium ions） 以及保留部分糖鏈結(jié)構(gòu)的肽段碎片離子。這些碎片信息為肽段序列鑒定和糖基化位點定位提供了充分證據(jù)。MS 和 MS/MS 譜圖均表現(xiàn)出優(yōu)異的質(zhì)量精度（< 6 ppm）和較高的信噪比，表明該平臺即使對于相對豐度不足 1% 的低豐度糖肽，也能夠獲得高質(zhì)量的 EThcD 碎裂譜圖，實現(xiàn)可靠的結(jié)構(gòu)解析和位點確認。（點擊查看大圖）
表1列出了阿柏西普中五個潛在糖基化位點相對含量前十的N-糖類型，可見各N-糖基化位點的糖型分布存在顯著差異。對于 N36、N123 和 N196 位點，主要糖型均為高唾液酸化糖型。相比之下，N68 位點最豐富的形式為未糖基化肽段，而位于Fc結(jié)構(gòu)域的 N282 位點則以 A2G1F、A2G0F 和 A2G2F 為最主要的三種糖型。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在 VEGFR1結(jié)構(gòu)域 的 N36 和 N68 位點，同時檢測到了雙天線和三天線高唾液酸化糖型；而在 VEGFR2結(jié)構(gòu)域 的 N123 和 N196 位點，則以雙天線高唾液酸化糖型占主導地位。這些結(jié)果表明，阿柏西普不同糖基化位點之間存在明顯的位點特異性。如此復雜且高度異質(zhì)的糖基化特征，也進一步凸顯了采用 EThcD碎裂技術(shù)開展深度N-糖基化表征的重要性。EThcD不僅能夠提供豐富的肽骨架碎片離子用于序列確認和位點定位，還能夠保留糖鏈結(jié)構(gòu)信息，從而實現(xiàn)復雜糖蛋白糖基化修飾的精準解析。表二列出了每個位點鑒定到的N-糖型數(shù)目，包含多種相對豐度小于0.1%的糖型，均可在三針重復進樣中被檢測到，證明了儀器平臺優(yōu)異的靈敏度。
表1. Trypsin酶切樣品中各N-糖基化位點鑒定到的豐度排名前10位的N-糖型。各糖型的相對豐度根據(jù)對應糖肽的質(zhì)譜信號強度（MS intensity）計算獲得；表中所示平均值（Average Relative Abundance）和變異系數(shù)（CV）均基于三次重復進樣分析結(jié)果統(tǒng)計得到。
表2. 各N-糖基化位點鑒定到的N-糖型總數(shù)、相對豐度≥0.1%的糖型數(shù)量以及相對豐度≥0.1%的糖型占全部已鑒定糖型的比例。糖型相對豐度基于三次重復進樣中對應糖肽的質(zhì)譜信號強度（MS intensity）計算獲得。
EThcD對于O-糖基化分析同樣具有獨特價值。阿柏西普此前的研究主要集中于N-糖基化，而關(guān)于O-糖基化的直接實驗數(shù)據(jù)十分有限。本研究成功檢測到位于S12位點的O-糖肽(圖4)，糖型為Hex(1)HexNAc(1)NeuAc(1)。令人印象深刻的是，該糖肽相對豐度僅為0.037%，卻依然獲得了97.8的鑒定得分，并在三次重復實驗中穩(wěn)定檢出。通過豐富的c6、c7、c8以及z12、z15等碎片離子，研究人員明確將糖基化位點定位于S12，而非肽段中的其他Ser/Thr位點。對于如此低豐度的O-糖肽，這種位點級別的確認充分體現(xiàn)了EThcD與高靈敏度Orbitrap平臺的協(xié)同優(yōu)勢。
圖4. ArgC酶切樣品中肽段 PFVEMYS(12)EIPEIIHMTEGR（3+，m/z = 979.112， O-糖鏈Hex(1)HexNAc(1)NeuAc(1)）的 EThcD MS² 譜圖。三價前體離子的全譜圖及局部放大圖顯示出豐富的診斷性 c/z 碎片離子（如 c?–c?、z?? 和 z??）、氧鎓離子（oxonium ions） 以及保留部分糖鏈結(jié)構(gòu)的肽段碎片離子。這些碎片信息共同支持了肽段序列的準確鑒定以及 O-糖基化位點的精準定位。盡管該 O-糖肽的相對豐度僅為 0.037%，EThcD 仍能夠提供充分的骨架碎裂信息和糖鏈相關(guān)診斷離子，實現(xiàn)對痕量 O-糖基化修飾的可靠鑒定和位點確認。（點擊查看大圖）
除了糖基化分析，EThcD在Asp異構(gòu)化表征方面的優(yōu)勢更加突出。Asp異構(gòu)化被認為是許多生物藥的重要質(zhì)量屬性之一，但傳統(tǒng)HCD產(chǎn)生的b/y離子無法區(qū)分Asp和isoAsp，因為兩者具有完全相同的質(zhì)量。EThcD則能夠產(chǎn)生特征性的c+57和z−57診斷離子對，從而直接確認異構(gòu)化的發(fā)生及其具體位置 (圖5A)。
研究中不僅成功鑒定了多個Asp異構(gòu)化位點，而且能夠?qū)卸鄠€Asp殘基的肽段實現(xiàn)精確定位。例如在肽段TTPPVLD(384)SD(386)GSFFLYSK中，研究人員通過特征z*−57離子成功區(qū)分了D384和D386兩個不同的異構(gòu)化位點。即使這些異構(gòu)體的相對豐度低至0.016%和0.036%，依然能夠獲得足夠質(zhì)量的EThcD譜圖完成可靠鑒定(圖5B)。這對于生物藥穩(wěn)定性研究、可比性評價以及MAM分析具有重要價值。
（A）
（B）
圖5. 阿柏西普（Aflibercept）中Asp異構(gòu)化（Asp Isomerization）的鑒定結(jié)果。A, EThcD碎裂用于Asp/isoAsp鑒定的原理示意圖。由于EThcD的碎裂機制，含有異天冬氨酸（isoAsp）的肽段能夠產(chǎn)生特征性的 c+57/z−57 診斷離子對，從而實現(xiàn)Asp與isoAsp的直接區(qū)分，并用于異構(gòu)化位點的確認。B，肽段 TTPPVLD(384)SD(386)GSFFLYSK（2+，m/z = 937.968）及其兩種不同異構(gòu)體的色譜圖和EThcD MS²譜圖。由于該肽段同時含有兩個Asp位點（D384和D386），EThcD產(chǎn)生的特征診斷離子能夠?qū)崿F(xiàn)位點級別的異構(gòu)化區(qū)分。其中isoD384 對應特征離子對 z??/z??−57 與isoD386 對應特征離子對 z?/z?−57 的相關(guān)診斷離子均在局部放大圖中進行了標注。（點擊查看大圖）
在本研究中，研究人員實現(xiàn)了在同一個分析流程中，同時完成了N-糖基化、O-糖基化、Asp/isoAsp異構(gòu)化、脫酰胺、氧化等多種關(guān)鍵質(zhì)量屬性的表征，并獲得100%序列覆蓋率。這種分析模式與當前生物制藥行業(yè)廣泛推廣的MAM(Multi-Attribute Method)理念高度契合，為復雜生物藥研發(fā)、工藝開發(fā)、質(zhì)量控制以及生物類似藥可比性評價提供了新的解決方案。
結(jié)語：
隨著監(jiān)管機構(gòu)和行業(yè)對于多屬性質(zhì)量監(jiān)控要求的不斷提高，高靈敏度、高質(zhì)量精度以及能夠提供豐富結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜平臺正在成為生物藥分析的核心工具。本研究表明，基于Orbitrap Excedion Pro和EThcD的分析策略，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)復雜糖蛋白的深度結(jié)構(gòu)解析，更能夠在單次實驗中完成多種關(guān)鍵質(zhì)量屬性的綜合評價，為下一代生物藥分析和MAM應用提供了強有力的技術(shù)支撐。
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