酒精中毒是全球性健康問題，單次急性酒精中毒更是后續(xù)濫用和成癮的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。傳統(tǒng)研究手段難以兼顧標(biāo)記需求與空間信息，而質(zhì)譜成像（MSI）作為空間組學(xué)核心技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)代謝物的原位、無標(biāo)記定性定量分析，為解析腦內(nèi)空間分子機(jī)制提供關(guān)鍵支撐。其中基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜成像(MALDI-MSI)應(yīng)用廣泛，開發(fā)高效高分辨的無基質(zhì)質(zhì)譜成像技術(shù)也成為領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。
近日，寧夏大學(xué)與中國科學(xué)院化學(xué)研究所合作在Chemical Engineering Journal發(fā)表：“Porous graphene films-enabled mass spectrometry imaging reveals metabolic asymmetry in mice after single-dose ethanol intoxication”的文章，該研究基于賽默飛Orbitrap Exploris 120 和TransMIT AP SMALDI 5AF高分辨質(zhì)譜成像平臺，創(chuàng)新性地開發(fā)了激光誘導(dǎo)石墨烯（LIG）基底輔助的激光解吸/電離質(zhì)譜成像技術(shù)，無需基質(zhì)噴涂即實(shí)現(xiàn)3μm超高分辨率成像，且兼具高靈敏度、低背景、操作簡便等優(yōu)勢，并揭示了單次酒精中毒后小鼠腦內(nèi)脂質(zhì)分布的時(shí)空動態(tài)不對稱現(xiàn)象，為酒精中毒的神經(jīng)代謝機(jī)制研究提供了全新視角。
圖1 研究框架(點(diǎn)擊查看大圖)
全新 LIG 基底：破解傳統(tǒng)質(zhì)譜成像技術(shù)痛點(diǎn)
研究采用激光誘導(dǎo)石墨烯作為LDI基底材料，只需通過CO?紅外激光掃描商業(yè)聚酰亞胺薄膜，即可在常溫常壓下快速制備出具有三維多孔結(jié)構(gòu)的石墨烯(圖1)。該結(jié)構(gòu)顯著增強(qiáng)了對質(zhì)譜離子源常用的343 nm激光的吸收(效率達(dá)97%)，同時(shí)多孔形貌有助于分析物的富集與捕獲，使得利血平檢測限可低至100 fmol。此外，該基底在質(zhì)譜檢測中背景信號極低，信噪比優(yōu)異，制備工藝簡單可控，每平方厘米材料成本僅約0.004美元，批間穩(wěn)定性RSD控制在2.1%以內(nèi)，具備良好的大規(guī)模應(yīng)用潛力。
圖2 LIG-LDI-MSI過程的示意圖
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基于Orbitrap & AP SMALDI實(shí)現(xiàn)3μm超高分辨成像
研究采用TransMIT AP-SMALDI 5AF與賽默飛Orbitrap Exploris 120高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)，將小鼠腦組織切片直接貼附于激光誘導(dǎo)石墨烯基底上，無需任何基質(zhì)噴涂，即可進(jìn)行激光解吸/電離質(zhì)譜成像。
在成像分辨率這一核心技術(shù)指標(biāo)方面，空間分辨率高達(dá)3μm(經(jīng)10-90%邊緣響應(yīng)驗(yàn)證，平均2.94±0.06μm)，圖3展示了3μm分辨率下清晰的組織結(jié)構(gòu)成像；同時(shí)實(shí)現(xiàn)了寬覆蓋檢測，將小鼠腦、肝組織切片直接置于 LIG 基底上，即可分別鑒定出 156 種和 324 種代謝物，涵蓋脂質(zhì)、核苷酸、氨基酸、神經(jīng)遞質(zhì)等多個類別。
圖3 LIG基底用于LDI-MSI的表征與性能評估
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機(jī)制研究表明，20μm厚腦組織切片對343 nm激光透過率約為92%，激光可有效穿透組織到達(dá)石墨烯基底，通過瞬時(shí)高溫(通過模擬對溫度值進(jìn)行了量化)實(shí)現(xiàn)高效解吸/電離，同時(shí)熱影響區(qū)嚴(yán)格受限，保證了高分辨率成像。
解鎖乙醇中毒腦代謝時(shí)空動態(tài)新機(jī)制
利用這一技術(shù)，研究團(tuán)隊(duì)對單次酒精中毒(3.5 g/kg乙醇腹腔注射)后不同時(shí)間點(diǎn)的年輕雌性小鼠腦組織進(jìn)行質(zhì)譜成像分析發(fā)現(xiàn)，9種脂質(zhì)分子在小腦、海馬體和皮層等腦區(qū)的左右兩側(cè)呈現(xiàn)出相似的動態(tài)翻轉(zhuǎn)規(guī)律：急性期(30分鐘)左側(cè)脂質(zhì)水平顯著低于右側(cè)；在中期(4小時(shí))雙側(cè)趨于平衡；而到了后期(24小時(shí))，這一趨勢發(fā)生逆轉(zhuǎn)，左側(cè)脂質(zhì)水平明顯高于右側(cè)。重復(fù)測量方差分析顯示，時(shí)間因素解釋了這一左右比值(L/R)變異的78.5%(p < 0.001)，效應(yīng)量很大(圖4)。
圖4 在不同條件下小鼠腦組織切片的LIG-LDI-MSI
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進(jìn)一步的腦區(qū)異質(zhì)性分析揭示，不同腦區(qū)對這一擾動的響應(yīng)模式和恢復(fù)節(jié)奏存在差異：小腦作為急性作用靶點(diǎn)，30分鐘即出現(xiàn)很強(qiáng)負(fù)效應(yīng)（Hedges' g = -3.29），但恢復(fù)迅速，24小時(shí)已基本回歸基線；而海馬體和大腦皮層的反應(yīng)更為復(fù)雜持久，不僅在急性期出現(xiàn)顯著下降，且在24小時(shí)均發(fā)生正效應(yīng)逆轉(zhuǎn)，尤其以大腦皮層的反轉(zhuǎn)幅度最為明顯(g = 1.41)，提示這些高級功能腦區(qū)可能涉及更復(fù)雜的后續(xù)調(diào)控與重塑過程。
技術(shù)展望：為生物醫(yī)學(xué)質(zhì)譜成像提供全新工具
激光誘導(dǎo)石墨烯(LIG)這一高性能無基質(zhì) LDI-MSI 基底，其制備簡便、成本低廉、性能優(yōu)異的特點(diǎn)，突破了傳統(tǒng)質(zhì)譜成像技術(shù)的瓶頸，為生物醫(yī)學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的空間分子機(jī)制研究中打開了新窗口。隨著技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化和拓展，其有望在疾病早期診斷、藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、代謝機(jī)制解析等方面發(fā)揮更大作用，為生命科學(xué)研究和臨床轉(zhuǎn)化提供更*的支撐。
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