前言
抗體-藥物偶聯(lián)物(antibody-drug conjugates, ADC)作為一類治療癌癥和自身免疫性疾病的生物醫(yī)藥類產(chǎn)品，近年來受到廣泛關(guān)注。ADC通常由單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb)通過可降解/不可降解的連接子(linker)與小分子藥物(drug)共價(jià)偶聯(lián)，這樣的設(shè)計(jì)確保ADC可通過單抗精確識(shí)別靶細(xì)胞后，進(jìn)入靶細(xì)胞并在胞內(nèi)裂解釋放小分子藥物，從而實(shí)現(xiàn)精確殺傷靶細(xì)胞的目的。與單抗產(chǎn)品相同，電荷異質(zhì)性也是ADC的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一，會(huì)對(duì)其質(zhì)量、安全性、穩(wěn)定性和效價(jià)等造成影響，故監(jiān)管機(jī)構(gòu)也對(duì)ADC的電荷異質(zhì)性表征提出了要求，作為ADC質(zhì)量控制的一部分。由于ADC結(jié)構(gòu)的高度異質(zhì)性，除單抗本身的修飾等帶來的電荷異質(zhì)性以外，連接子、小分子藥物等均有可能引入新的電荷異質(zhì)性，這使得ADC的電荷異質(zhì)性分析頗具挑戰(zhàn)性。
在本文的研究中，我們開發(fā)了基于在線多中心切割的2D UHPLC – native intact MS ADC電荷異構(gòu)體分析方案，對(duì)市售的半胱氨酸偶聯(lián)ADC Polivy® 的電荷異質(zhì)體進(jìn)行了分析。第一維的分離采用強(qiáng)陽離子交換色譜 (strong cation exchange， SCX)，第二維使用體積排阻色譜(size exclusion chromatography, SEC )并使用與質(zhì)譜可以兼容的醋酸銨緩沖體系，確保半胱氨酸偶聯(lián)ADC的鏈間非共價(jià)結(jié)合不會(huì)被破壞，能夠保持完整狀態(tài)進(jìn)行質(zhì)譜分子量分析，并測定其藥物-抗體比率 (Drug-antibody ratio, DAR)等關(guān)鍵質(zhì)量屬性。Thermo Scientific™ Vanquish™ Online 2D-LC 系統(tǒng)與 Orbitrap™ Exploris™ 240 BioPharma超高分辨二合一質(zhì)譜儀被用于分析，整體工作流程見圖1。
圖1. SCX-SEC-native intact MS 用于半胱氨酸偶聯(lián)ADC 工作流程示意圖。(點(diǎn)擊查看大圖)
方案亮點(diǎn)
亮點(diǎn)一：
Thermo Scientific™ ProPac™ 3R SCX 色譜柱與CX-1™ pH 梯度緩沖液配合使用，可在第一維色譜上對(duì)ADC電荷異構(gòu)體進(jìn)行有效分離。
本研究中第一維分離使用ProPac 3R SCX 色譜柱，該色譜柱采用3µm單分散填料，能夠?qū)DC的電荷異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)更好分離。CX-1™ pH 梯度緩沖液可以建立線性pH梯度，使用方便，重現(xiàn)性好，二者配合使用可在第一維強(qiáng)陽離子交換色譜上對(duì)Polivy的電荷異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)良好分離 (圖2)。
圖2. ¹D SCX (上) 與 ²D SEC (下) UV 譜圖，SEC譜圖為三個(gè)不同餾分(105 μL ¹D洗脫液)，證明了反沖(黑色)與正沖(粉色)相比，可顯著改善²D SEC的峰型并提高其靈敏度。(點(diǎn)擊查看大圖)
亮點(diǎn)二：
第二維反沖（backflush）及多中心切割可改善二維SEC峰型，提高其靈敏度，醋酸銨體系的使用可以實(shí)現(xiàn)與質(zhì)譜的在線直連。
由于一維的SCX緩沖液體系中含有大量與質(zhì)譜不兼容的緩沖鹽，故二維的SEC就顯得必不可少，可以在除去一維體系中緩沖鹽的同時(shí)，使半胱氨酸偶聯(lián)ADC保持近天然狀態(tài)，被送入質(zhì)譜進(jìn)行在線完整分子量測定。二維色譜的流路連接如圖3，第一維分離后的餾分按設(shè)置好的時(shí)間窗口被依次收集至樣品環(huán)中，其流路設(shè)計(jì)確保每個(gè)餾分以反沖的方式從樣品環(huán)中被送入二維色譜柱，可以改善二維SEC的峰型并提高其靈敏度(圖2/3)。
圖3. 多中心切割2D-LC-HRAM MS 系統(tǒng)流路圖，(A) 反沖， (B) 正沖。收集一維餾分的樣品環(huán)體積為250 μL。(點(diǎn)擊查看大圖)
亮點(diǎn)三：
Orbitrap Exploris 240 BioPharma 超高分辨二合一質(zhì)譜儀可在非變性條件下對(duì)半胱氨酸偶聯(lián)ADC進(jìn)行完整分子量測定，其高靈敏度有助于低豐度組分的準(zhǔn)確鑒定。
在本文的研究中，第一維SCX分離總共鑒定到18個(gè)色譜峰(圖4)，將18個(gè)峰按保留時(shí)間分為4組，每針進(jìn)樣依次收集一組峰并送至質(zhì)譜進(jìn)行在線完整分子量分析，每個(gè)峰僅收集一次。得益于Orbitrap質(zhì)譜的超高靈敏度，即使是相對(duì)豐度僅有0.43%的18號(hào)峰也可通過單次收集進(jìn)行高分辨質(zhì)譜的在線分析。
圖4. ¹D SCX UV譜圖，總共分離并鑒定到了18個(gè)色譜峰。下方的表格展示了每個(gè)峰的相對(duì)豐度及轉(zhuǎn)移至2D SEC的每個(gè)餾分的體積。(點(diǎn)擊查看大圖)
圖5展示了8號(hào)及9號(hào)兩個(gè)相對(duì)豐度最高的峰非變性質(zhì)譜完整分子量測定的結(jié)果。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，8號(hào)峰主要以偶聯(lián)兩個(gè)藥物的相關(guān)組分為主，9號(hào)峰主要以偶聯(lián)四個(gè)藥物的相關(guān)組分為主，說明偶聯(lián)藥物數(shù)目會(huì)對(duì)ADC的電荷異質(zhì)性造成影響。
圖5. 圖4中8號(hào)峰及9號(hào)峰的一級(jí)質(zhì)譜圖及解卷積結(jié)果。左，m/z=5000~7000Da，一級(jí)質(zhì)譜圖。中，左圖紅色陰影區(qū)域放大，可見不同組分的質(zhì)譜峰分布。右，解卷積結(jié)果。(點(diǎn)擊查看大圖)
對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，單抗本身的修飾，如重鏈末端賴氨酸丟失、脫酰胺和氧化等也會(huì)對(duì)ADC電荷異質(zhì)性造成影響。以11號(hào)峰和12號(hào)峰為例，11號(hào)峰中主要組分為D2+1Lys與D4+0Lys，12號(hào)峰中主要組分為D4+1Lys與D6+0Lys (圖6)，在其他峰中也可觀察到類似的Dn+1Lys與Dn+1+0Lys分布模式，進(jìn)一步證明了ADC電荷異構(gòu)體的高度復(fù)雜性和使用超高分辨質(zhì)譜對(duì)ADC電荷異構(gòu)體進(jìn)行分析的必要性。
圖6. 圖4中11號(hào)峰及12號(hào)峰的一級(jí)質(zhì)譜圖及解卷積結(jié)果。左，m/z=5000~7000Da，一級(jí)質(zhì)譜圖。中，左圖紅色陰影區(qū)域放大，可見不同組分的質(zhì)譜峰分布。右，解卷積結(jié)果，可見賴氨酸變體導(dǎo)致的Dn+1Lys與Dn+1+0Lys分布模式。(點(diǎn)擊查看大圖)
如前文所述，即使是相對(duì)豐度只有0.43%的18號(hào)峰，得益于質(zhì)譜平臺(tái)的高靈敏度，單針進(jìn)樣并分離的18號(hào)峰仍然能夠得到高信噪比的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)蛋白分子量的準(zhǔn)確鑒定。如圖7所示，該峰中主要包括D4、D6及D6和D8的賴氨酸變體，再次證明了前端分離技術(shù)和質(zhì)譜平臺(tái)的靈敏度、分辨率及質(zhì)量精度對(duì)痕量ADC電荷異構(gòu)體鑒定的必要性。
圖7. 18號(hào)峰的 ¹D UV譜圖(上)及 ²D質(zhì)譜圖和解卷積譜圖(下)。(點(diǎn)擊查看大圖)
圖8總結(jié)了¹D SCX分離后各個(gè)色譜峰中由質(zhì)譜所鑒定到的主要組分，可見藥物偶聯(lián)數(shù)目及抗體本身的翻譯后修飾均會(huì)對(duì)ADC的電荷異質(zhì)性產(chǎn)生影響。
圖8. ¹D SCX分離的各個(gè)色譜峰中主要成分匯總(左表)。脫酰胺和氧化多于酸性峰中被鑒定到，賴氨酸變體多見于堿性峰中。隨偶聯(lián)藥物數(shù)目的增加，ADC在SCX柱上的保留時(shí)間也相應(yīng)增加。(點(diǎn)擊查看大圖)
結(jié)語：
本文開發(fā)了一種基于在線多中心切割的SCX-SEC-native intact MS 半胱氨酸偶聯(lián)ADC電荷異構(gòu)體分析方案，將其應(yīng)用于半胱氨酸偶聯(lián)ADC Polivy的電荷異質(zhì)體分析中，并能得到良好結(jié)果。ProPac 3R SCX 色譜柱與CX-1 pH 梯度緩沖液配合使用，可實(shí)現(xiàn)ADC電荷異構(gòu)體在第一維色譜上的有效分離，反沖能夠改善第二維SEC的色譜峰型并提高靈敏度，Orbitrap Exploris 240 BioPharma二合一超高分辨質(zhì)譜儀能夠?qū)DC的各個(gè)異構(gòu)體組分進(jìn)行鑒定，包括痕量組分。該平臺(tái)普適性強(qiáng)，可對(duì)不同mAb/BsAb/ADC等生物分子進(jìn)行電荷異質(zhì)性分析。
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