引 言
烏頭、附子中的烏頭堿，馬錢子中的士的寧、馬錢子堿均為劇毒生物堿, 微量即可導(dǎo)致嚴重中毒甚至死亡。2020 年版《中國藥典》中仍有近 60 個中成藥及中藥材品種使用烏頭堿、士的寧的對照品，作為嚴格管控的劇毒物質(zhì)，公安部要求已不再發(fā)放相應(yīng)的對照品[1]。為確保藥典標準的科學(xué)性、合理性和適用性，亟需以烏頭雙酯型生物堿、馬錢子總生物堿的對照提取物來替代烏頭堿、士的寧的對照品。早在 2016 年，中國食品藥品檢定研究院就開始了相關(guān)研究工作[2] [3]；近期，國家藥典委員會完成了 57 個相關(guān)品種的增修訂, 并收載入 2025 年版《中國藥典》[1]。
烏頭雙酯型生物堿
烏頭雙酯型生物堿 (烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等，劇毒) 經(jīng)炮制 (浸泡、蒸煮、砂燙等) 后，C-8 位乙?；馍蔀躅^單酯型生物堿 (如苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿等，低毒)，而 C-14 位苯甲?；M一步水解生成烏頭醇胺型生物堿 (如烏頭原堿、新烏頭原堿、次烏頭原堿等，微毒) [4]，如圖 1 所示。
川烏 (制川烏)、草烏 (制草烏) 和附子中所含的烏頭雙酯型生物堿主要為烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等，而黃草烏 (制黃草烏) 中所含的烏頭雙酯型生物堿主要為滇烏頭堿、草烏甲素等[5]。目前市售的烏頭雙酯型生物堿對照提取物含量以新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿三種計，且部分中成藥品種中烏頭雙酯型生物堿的測定，受樣品基質(zhì)干擾較為嚴重。賽默飛實驗室建立一種涵蓋 5 種烏頭雙酯型生物堿和 3 烏頭單酯型生物堿的測定全新方法，以便于制藥企業(yè)更全面地控制相關(guān)制劑的質(zhì)量。
圖 1 8 種烏頭堿結(jié)構(gòu)式
生附片特征圖譜 賽默飛完整應(yīng)用解決方案
01
對照品溶液及供試品溶液的制備
8 種烏頭堿對照品溶液均購自標準品供應(yīng)商，2 批次江油生附片供試品溶液均由客戶提供。
對照品溶液的制備：取苯甲酰新烏頭原堿對照品、苯甲酰烏頭原堿對照品、苯甲酰次烏頭原堿對照品、新烏頭堿對照品、烏頭堿對照品、次烏頭堿對照品、滇烏頭堿對照品、粗莖烏頭堿甲 (草烏甲素) 對照品溶液適量，精密稱定，加乙腈制成每 1 mL 各含 10 μg 的混合溶液，即得。
供試品溶液的制備：取本品粉末約 1.0 g，精密稱定，置于 25 mL 具塞玻璃試管中，準確加入異丙醇-乙酸乙酯 (1:1) 混合溶液 10 mL(含氨試液 0.6 mL)，密塞，冰水浴超聲提取 30 min，室溫靜置沉降。移取 5 mL 上清液至 15 mL 離心管中，8000 rpm 20 ℃ 離心 5 min，準確取 4.00 mL 至潔凈氮吹管中 30 ℃ 水浴氮吹至近干，準確加入 2.00 mL 乙腈復(fù)溶(渦旋/超聲/渦旋)， 5000 rpm 20 ℃ 離心 3 min，復(fù)溶液過 0.2 μm 親水性 PTFE 濾膜 (P/N: 42213-NPL)，濾液待上機測試。
測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各 5 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。
02
儀器配置及色譜條件
Thermo Scientific™ Vanquish Core™ 高效液相色譜系統(tǒng)，配置：泵 Quaternary Pump C (VC-P20-A)，自動進樣器 Split Sampler CT (VC-A12-A)，柱溫箱 Column Compartment C (VC-C10-A)，檢測器 Diode Array Detector CG (VC-D11-A)，數(shù)據(jù)處理 Chromeleon™ 7.3
色譜柱：Acclaim Mixed-Mode WCX-1, 3 μm, 3.0×150 mm (P/N: 070092)
流動相：A: 超純水 B: 100 mM (NH4)H2PO4 (磷酸調(diào)節(jié) pH 至 3.0) C: 乙腈
流速：0.5 mL/min
梯度洗脫程序：詳見附件應(yīng)用解決方案
進樣量：5 µL
柱溫：40 ℃
檢測器：DAD, 采集波長: 230 / 260 nm；采集頻率: 5 Hz；光譜采集: 190-400 nm
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03
譜圖及數(shù)據(jù)
3.1 對照品溶液譜圖
圖 2 8 種烏頭堿混合對照品溶液分離譜圖及數(shù)據(jù) (10.0 μg/mL)(點擊查看大圖)
圖 3 8 種烏頭堿單一對照品溶液定位譜圖 (10.0 μg/mL)(點擊查看大圖)
供試品溶液中 8 種烏頭堿均可實現(xiàn)有效分離，其中 5 種烏頭雙酯型生物堿峰形良好，柱效優(yōu)異，可準確定性和定量；3 種烏頭單酯型生物堿中苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿未能基線分離，可用于初步定性分析。
3.2 供試品溶液譜圖
圖 4 生附片供試品溶液分離譜圖及數(shù)據(jù) (S1)
(點擊查看大圖)
圖 5 生附片供試品溶液分離譜圖及數(shù)據(jù) (S2)
(點擊查看大圖)
兩批次生附片中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿均有檢出，目標峰均可實現(xiàn)基線分離和準確定性定量，而滇烏頭堿和草烏甲素均未檢出。
3.3 生附片特征圖譜
圖 6 生附片供試品溶液中新烏頭堿相鄰峰的光譜圖
(點擊查看大圖)
230 nm 下，生附片供試品溶液中新烏頭堿目標峰前后分可出兩個未知峰，通過光譜圖識別，疑似為其他類型烏頭雙酯型生物堿，后續(xù)可開展相應(yīng)的研究。
圖 7 6 種烏頭堿對照品溶液與生附片供試品溶液疊加譜圖(點擊查看大圖)
生附片供試品溶液連續(xù)進樣疊加譜圖中，各目標峰保留時間和峰面積穩(wěn)定，RSD 均小于 1%，方法重現(xiàn)性和穩(wěn)定性優(yōu)異，可用于生附片中烏頭雙酯型生物堿特征圖譜的建立。
04
結(jié)果與討論
1)本試驗采用 Acclaim Mixed-Mode WCX-1 混合模式色譜柱 (反相+弱陽離子交換) 及不含離子對試劑或*的流動相，配合 Vanquish Core 高效液相色譜系統(tǒng)，可有效分離 8 種烏頭堿，其中 5 種烏頭雙酯型生物堿峰形良好，柱效優(yōu)異，可準確定性和定量，3 種烏頭單酯型生物堿可用于初步定性分析。
2)針對供試品溶液中 5 種烏頭雙酯型生物堿的分離進行色譜條件的優(yōu)化，新烏頭堿峰前后分出兩個未知峰，通過光譜圖識別疑似為其他烏頭雙酯型生物堿，而滇烏頭堿和草烏甲素均未檢出。
3) 本方法既適用于生附子加工炮制過程中烏頭堿水解程度的監(jiān)測，又可用于川附子和滇附子道地藥材的產(chǎn)地溯源。
5. 參考文獻
[1] 李浩,申明睿,張鵬,等.2025年版《中國藥典》一部主要增修訂內(nèi)容介紹[J].中國藥品標準,2025,26(01):17-22.DOI:10.19778/j.chp.2025.01.003.
[2] 朱月,王瑞忠,張聿梅,等.雙酯型烏頭生物堿對照提取物的制備及其應(yīng)用研究[J].中國藥品標準,2016,17(04):252-257.DOI:10.19778/j.chp.2016.04.003.
[3] 王菲菲,吳壽海,張聿梅,等.馬錢子對照提取物的研究及其在馬錢子藥材及復(fù)方制劑質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].藥物分析雜志,2018,38(07):1226-1230.DOI:10.16155/j.0254-1793.2018.07.18.
[4] 胡家豪,李文儒,時慶欣,等.附子化學(xué)成分與炮制工藝研究進展[J].中國中藥雜志,2025,50(06):1458-1470.DOI:10.19540/j.cnki.cjcmm.20241214.201.
[5] 徐怡,秦波,曹紅云,等.HPLC法同時測定黃草烏中滇烏堿和草烏甲素的含量[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2017,38(09):70-72.DOI:10.16254/j.cnki.53-1120/r.2017.09.033.
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