司美格魯肽
司美格魯肽，結(jié)構(gòu)見圖1[1]，是一種長效的胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1,GLP-1)受體激動劑，但近年來，它以“減肥神藥”的姿態(tài)迅速走紅全球，成為抗肥胖治療領(lǐng)域的重磅藥物。其機制來自對GLP-1受體的模擬——這種腸道激素可增強胰島素分泌、抑制胃排空并作用于大腦中樞，減少饑餓感，讓人“吃得少、瘦得快”。數(shù)據(jù)顯示，2023年全球GLP-1類藥物市場規(guī)模已突破300億美元，而肥胖市場的擴張使這一數(shù)字有望在2028年飆升至700億美元。在眾多GLP-1藥物中，司美格魯肽(商品名如Ozempic用于糖尿病、Wegovy用于減肥)憑借每周僅需注射一次、降重效果顯著(平均體重可降低15%以上)，贏得了醫(yī)生和消費者的廣泛青睞。隨著市場需求井噴式增長，對司美格魯肽的高質(zhì)量、大規(guī)模生產(chǎn)也提出了更高要求。司美格魯肽現(xiàn)有的合成工藝分兩類，一類是原研選擇的生物發(fā)酵結(jié)合化學(xué)合成的方法完成成品的制備；一類是多肽固相合成以及片段縮合的合成方法。多肽合成工藝過程產(chǎn)生的雜質(zhì)如氨基酸缺失、取代或插入肽、截斷肽等，這些雜質(zhì)與目標(biāo)多肽的性質(zhì)接近，給常規(guī)反相液相色譜的分離帶來挑戰(zhàn)。司美格魯肽及其相關(guān)雜質(zhì)的反相液相色譜分離使用酸性磷酸氫二銨作為流動相，而磷酸氫二銨是質(zhì)譜不兼容的流動相。
圖1. 司美格魯肽結(jié)構(gòu)
二維液相
對復(fù)雜的多肽雜質(zhì)問題，傳統(tǒng)的一維色譜往往力不從心。尤其是像司美格魯肽這類雜質(zhì)性質(zhì)相近的多肽藥物，哪怕是經(jīng)驗豐富的分析專家，也常常陷入“分不清、測不準(zhǔn)”的困境。此時，二維液相色譜(2D-LC)技術(shù)就像“顯微鏡+掃描儀”的組合，不僅看得清，還能自動分類、高效識別。二維液相（2D-LC）是一種不改變一維液相分離度和流動相組成且能在線對雜質(zhì)和目標(biāo)多肽進(jìn)行高效鑒定的途徑。多中心切割2D-LC可以實現(xiàn)一針樣品在線切割多個雜質(zhì)，然后通過二維泵依次沖洗到二維色譜柱中進(jìn)行除鹽、洗脫和質(zhì)譜鑒定，圖2為儀器流路圖。
圖2. 多中心2D-LC串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀器流路圖(e為loop)
儀器配置
Thermo Fisher Vanquish Duo多中心二維液相色譜儀串聯(lián)高分辨質(zhì)譜Orbitrap Exploris 120
泵*2：Binary Pump F(PN:VF-P10-A)
自動進(jìn)樣器：Split Sampler FT(PN:VF-A10-A)
柱溫箱*2：Column Compartment H(PN:VH-C10-A)
VWD檢測器：Variable Wavelength Detector F(PN:VF-D40-A)
質(zhì)譜檢測器：Orbitrap Exploris 120(PN: BRE725531)
一維色譜柱：Hypersil gold peptide 2.1*150 mm 1.9 μm
二維色譜柱：Hypersil gold C8 2.1*50 mm 1.9 μm
實驗結(jié)果：
1 一維方法重復(fù)性
本文采用Hypersil gold peptide小粒徑色譜柱和Vanquish Flex超高效液相對司美格魯肽原料藥進(jìn)行純度分析，連續(xù)進(jìn)樣3次，色譜結(jié)果重復(fù)性好，見圖3和表4。
圖3 司美格魯肽3針一維純度分析結(jié)果疊圖
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表4 連續(xù)進(jìn)樣3次的峰（圖3“√”的3個色譜峰）保留時間和峰面積RSD
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2 多中心2D-LC-MS鑒定
面積歸一法進(jìn)行峰面積計算，對于圖4中含量遠(yuǎn)低于0.1%的峰peak1，分別進(jìn)行5次在線loop富集，考察在線富集效果。peak1未在線富集進(jìn)行二維除鹽后的質(zhì)譜圖見圖5的A和C，C為質(zhì)荷比1032處放大；peak1進(jìn)行在線富集5次后進(jìn)行二維除鹽后的質(zhì)譜圖見圖5 的B和D，D為質(zhì)荷比1032處放大，可以看出在線富集效果顯著，質(zhì)譜圖的響應(yīng)達(dá)到2.4E5，可以進(jìn)行有效數(shù)據(jù)解析。peak1單同位素分子量4125.1021 Da, 在線富集5次后的二級碎片離子覆蓋度見圖6。
圖4中含量高于0.1%的peak2-peak11及主峰，進(jìn)行直接在線除鹽和質(zhì)譜鑒定。圖7和圖8展示主峰前的peak2和peak3的質(zhì)譜定性結(jié)果。通過上述方法結(jié)合Thermo BioPharmaFinder5.3軟件鑒定該司美格魯肽的雜質(zhì)有氧化肽、酰胺化肽、缺失肽等。
圖4 多中心2D-LC-MS鑒定的峰
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圖5 未富集的peak1的質(zhì)譜圖和5次進(jìn)樣在線富集到loop后的質(zhì)譜圖(點擊查看大圖)
圖6 5次富集后的peak1(4125.1021 Da)的二級碎片離子覆蓋度(點擊查看大圖)
圖7 peak2(分子量為單同位素峰為3472.7290 Da的缺失肽雜質(zhì))的二級碎片離子覆蓋度(點擊查看大圖)
圖8 peak3(分子量為單同位素峰為4127.1172 Da的氧化肽雜質(zhì))的二級碎片離子覆蓋度(點擊查看大圖)
結(jié)論：
1、利用Hypersil gold peptide專用色譜柱和超高效液相色譜Vanquish Flex能對該司美格魯肽原料藥的純度進(jìn)行較好的分離，且重復(fù)性好。
2、多中心2D-LC-MS對含量非常低的peak1進(jìn)行在線富集再除鹽進(jìn)質(zhì)譜響應(yīng)，比未富集的peak1的質(zhì)譜響應(yīng)明顯提高。未富集的peak1的質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)量沒法進(jìn)行解析。通過此在線富集方式，可以提高至少5倍的檢測靈敏度，該方法對于低含量的物質(zhì)的鑒定，具有很好的借鑒價值。
3、本方法對于含量不低于0.1%的雜質(zhì)和主峰進(jìn)行至少一次實驗可以切割5個餾分，然后依次在線除鹽進(jìn)質(zhì)譜鑒定，鑒定出該司美格魯肽具有雜質(zhì)：W25氧化肽、E21酰胺化肽、缺失肽等。多中心2D-LC方法相比較傳統(tǒng)的單中心2D-LC方法效率提高5倍。
4、借助變色龍軟件eWorkflow的優(yōu)勢，該方法可以便捷地轉(zhuǎn)移到各種多肽類藥物、小分子藥物、生物藥等2D-LC-MS的雜質(zhì)鑒定。
參考文獻(xiàn)：
[1]Sanjay Kalra,Rakesh Sahay.A review on semaglutide:an oral glucagon-like peptide 1 receptor agonist in management of type2 diabetes mellitus[J].2020.06.
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