動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)開始于本世紀(jì)初,發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法, 利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價(jià)值的酶、生長(zhǎng)因子、疫苗和單抗等, 已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分。
由于動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性、相關(guān)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和質(zhì)量以及一致性要求, 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)仍難于滿足具有重要醫(yī)用價(jià)值生物制品的規(guī)模生產(chǎn)的需求, 迫切需要進(jìn)一步研究和發(fā)展細(xì)胞培養(yǎng)工藝。目前, 世界眾多研究領(lǐng)域集中在優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境、改變細(xì)胞特性、提高產(chǎn)品的產(chǎn)率并保證其質(zhì)量和一致性上。
細(xì)胞培養(yǎng)定義：
細(xì)胞培養(yǎng)是將活體組織或細(xì)胞從試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)取出，放在模擬體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境(無菌、適溫、營養(yǎng)豐富)中，使高體細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育的一種方法。按照培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)成分不同，將其分為組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)及器官培養(yǎng)等。根據(jù)細(xì)胞是否在支持物上生長(zhǎng)，將其分為貼壁型和懸浮型。一般來說，圓形細(xì)胞如淋巴細(xì)胞屬于懸浮型，而胞體梭型(成纖維型細(xì)胞)、扁平不規(guī)則(上皮型細(xì)胞)等屬于貼壁型，貼壁型細(xì)胞必需貼附在支持物表面生長(zhǎng)。
細(xì)胞培養(yǎng)目前主要應(yīng)用于：
1、在病毒學(xué)中的應(yīng)用
2、在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用
3、在藥理學(xué)中的應(yīng)用
4、在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用
5、在其他方面的應(yīng)用
本節(jié)引自：占今舜的《細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展》
?
1 細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境
細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是提高細(xì)胞密度的主要限制因素。
1、體外動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中氨離子的積累是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的主要因素之一。氨來源于兩方面:一是直接來源于培養(yǎng)基, 一是細(xì)胞代謝所產(chǎn)生。但兩者都涉及谷氨酰胺, 因此需要防止培養(yǎng)基中Gln 自然分解, 限制Gln 用量, 并盡量去除培養(yǎng)基中的氨。
2、乳酸是細(xì)胞糖代謝的產(chǎn)物：其中比較有效果的措施是降低培養(yǎng)基中葡萄糖濃度以減少乳酸產(chǎn)生的同時(shí), 必須平衡葡萄糖和Gln 的比例。這些代謝改變機(jī)理的研究將有利于設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)目刂品桨浮?br />
3、隨著細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模和培養(yǎng)密度的增大, 二氧化碳的產(chǎn)生速率比通過換氣從培養(yǎng)基中去除二氧化碳快因而導(dǎo)致CO2 積聚, 從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用或者改變細(xì)胞代謝水平。所以控制通氣參數(shù), 平衡氧的輸送及CO2 的去除, 防止生物反應(yīng)器運(yùn)轉(zhuǎn)中CO2 積聚仍是明智選擇。
4、甲基乙二醛(MG)主要是丙糖磷酸去除磷酸基
后的代謝產(chǎn)物, 也是脂類、氨基酸代謝的產(chǎn)物, 對(duì)于細(xì)胞有潛在的損傷作用。通過批次培養(yǎng)中限制葡萄糖用量來降低葡萄糖消耗, 由此來確定降低糖酵解代謝是否導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MG 濃度降低, 從而zui終確定MG 濃度降低。
5、滲透壓對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。高滲透壓不僅影響細(xì)胞批次培養(yǎng)中產(chǎn)量, 而且影響細(xì)胞生長(zhǎng)速度、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的長(zhǎng)短、細(xì)胞死亡的速度等?？梢杂肗aCl 、KCl 還是蔗糖濃度調(diào)節(jié)滲透壓。
6、機(jī)械攪拌與噴氣損傷。目前用多孔微載體替代了容易使細(xì)胞受機(jī)械攪拌與噴氣損傷的常規(guī)載體。
2 細(xì)胞死亡與凋亡
大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的后期, 維持細(xì)胞高的活力是個(gè)富有挑戰(zhàn)性的課題。zui初的研究似乎表明細(xì)胞死亡大多由于壞死, 而人們逐漸認(rèn)識(shí)到至少是一些細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中細(xì)胞死亡主要原因是細(xì)胞凋亡。隨著細(xì)胞凋亡分子機(jī)制研究的不斷深入, 細(xì)胞凋亡的發(fā)生被認(rèn)為是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過程的重要制約環(huán)節(jié), 預(yù)防并控制細(xì)胞凋亡也因此成為研究熱點(diǎn)。用基因工程方法將bcl -2 基因這種細(xì)胞凋亡抑制基因?qū)爰?xì)胞, 成為眾多研究者的選擇。
發(fā)酵人，大家的好伙伴
3 培養(yǎng)基與細(xì)胞系
動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞賴以體外生長(zhǎng)、增殖、分化的重要因素。在經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)后, 無血清培養(yǎng)基成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域研究的一大課題。無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)在于避免了血清的批次、質(zhì)量、成分等對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)造成的污染、毒性作用和不利于產(chǎn)品純化等不良影響。
zui近研究表明, 先使野生型宿主CHO細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng), 然后轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞得到的重組克隆在基因擴(kuò)增后保持了在無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)中的生長(zhǎng)能力, 其產(chǎn)品在生化和結(jié)構(gòu)上類似于未處理的宿主細(xì)胞產(chǎn)物。
?
4 過程監(jiān)控
大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中由于大量細(xì)胞的代謝,細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境迅速改變, 在線過程監(jiān)控更為重要。在生物反應(yīng)器中, 溫度、pH 值、溶解氧濃度是細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模放大的早期研究?jī)?nèi)容。現(xiàn)在, 這三個(gè)參數(shù)對(duì)細(xì)胞的影響已經(jīng)明確, 并在培養(yǎng)過程中實(shí)行了有效控制。
測(cè)量在線氧吸收速率確定從細(xì)胞生長(zhǎng)期生產(chǎn)病毒到病毒感染期和細(xì)胞死亡后終止感染的轉(zhuǎn)換時(shí)間;用在線葡萄糖分析儀的測(cè)定調(diào)整灌流速度;測(cè)定氧消耗估計(jì)營養(yǎng)供應(yīng)率的代謝負(fù)荷和控制;測(cè)定氧吸收速率估測(cè)ATP 的形成;測(cè)量在線氧化還原能力作為活細(xì)胞濃度的指標(biāo)等等眾多特定參數(shù)均得以測(cè)定并加以應(yīng)用。用親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)進(jìn)行在線蛋白質(zhì)含量測(cè)定的方法已經(jīng)完成。另外, 用在線蛋白分解與反相色譜監(jiān)測(cè)重組蛋白的糖基化以了解產(chǎn)品的一致性也成為一項(xiàng)有應(yīng)用價(jià)值的技術(shù)。
1~4引自林福玉《大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的問題及對(duì)策》
5 三維立體微環(huán)境
細(xì)胞生長(zhǎng)離不開三維立體微環(huán)境中各種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)( extra - cellular matrix，ECM) 間相互粘附等多種信號(hào)的調(diào)節(jié)。體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)就是在體外維持細(xì)胞、組織及器官生存及生長(zhǎng)的一種技術(shù)
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過不斷的改進(jìn)，經(jīng)歷了由二維到三維，由靜止三維培養(yǎng)到動(dòng)力三維培養(yǎng)的過程。本節(jié)引自宋鴻《細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展》
6 微生物污染及處理方法
細(xì)胞培養(yǎng)污染是指培養(yǎng)環(huán)境中侵入了對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞變異的異物。生物污染一般包括：細(xì)菌、霉菌、支原體、病毒、黑蛟蟲污染，還有細(xì)胞交叉污染。下面主要對(duì)黑蛟蟲污染進(jìn)行簡(jiǎn)述。
黑蛟蟲是一種生物還是非生物，學(xué)術(shù)界還有爭(zhēng)論。其污染特點(diǎn)為開始對(duì)細(xì)胞無影響，當(dāng)數(shù)量達(dá)到一定程度時(shí)就會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。受黑蛟蟲污染的細(xì)胞液通常清亮無變化。污染主要來源于血清，400倍顯微鏡下可見點(diǎn)狀或片狀游動(dòng)小體。
黑蛟蟲早期污染一般采用如下方法: 用0.25%的胰酶消化，當(dāng)有少量細(xì)胞變圓或脫壁時(shí)，用血清終止消化，輕輕用培養(yǎng)基或D-Hanks 液清洗3 遍( 緩慢流過細(xì)胞表面) ，不要吹打，然后吹散細(xì)胞，換培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，隔天換液。2 d 后重復(fù)一次，以后每24 ～ 36 h換1 次液，1周后，黑點(diǎn)可基本消失。也可用麥諾霉素10 mg /L 處理，連續(xù)1 周，但麥諾霉素對(duì)細(xì)胞有毒性。
本節(jié)引自吳文亮《細(xì)胞培養(yǎng)中污染的防控措施》
