齊一生物科技（上海）有限公司
免費會員
 提 供 商 |
齊一生物科技（上海）有限公司 |  資料大小 |
23.3KB |
|---|---|---|---|
 資料類型 |
PNG 圖片 |  資料圖片 |
|
 下載次數 |
131次 |
乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）試劑盒說明書
分光光度法 50 管/24 樣
測定意義：
LDH（EC 1.1.1.27）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是糖酵解途徑的末端酶，
催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應，伴隨著 NAD+/NADH 之間互變。
測定原理：
LDH 催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸， 丙酮酸進一步與2, 4 - *肼作用生成丙酮酸二
硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰
和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：30mL×1 瓶， 4℃保存；
試劑一：液體15 mL×1 瓶， 4℃保存；
試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存，用時加入 1.3 mL 蒸餾水充分溶解備用，配好后-20℃保存，
可保存兩周，禁止反復凍融；
試劑三：液體15 mL×1 瓶，4℃保存；
試劑四：液體50 mL×1 瓶，4℃保存；
樣品測定的準備：
1、細菌、細胞或組織樣品的制備：
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量
（104
個） ：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議500 萬細菌或細胞加入1mL 提
取液） ，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔10s，重復 30 次） ；
8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質量（g） ：提取液體積(mL)為 1：5~10的比例（建議稱取約 0.1g組織，
加入1mL 提取液） ，進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
1、分光光度計預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 450nm，蒸餾水調零。
2、樣本測定（在 EP 管中加入下列試劑）
試劑名稱(μL) 測定管 對照管
樣本 50 50
試劑一 250 250
試劑二 50
蒸餾水 50
充分混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴15min
試劑三 250 250
充分混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴15min
試劑四 750 750
充分混勻，室溫靜置3 分鐘，450 nm 下測定吸光度，計算ΔA=A 測定管-A對照管。每個測
定管需要設一個對照管。LDH 活力單位的計算：
1、標準條件下測定的回歸曲線， y = 0.725x (x 為標準品濃度，umol/mL；y 為對吸光度)。
2、血清（漿）LDH 活力的計算
單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH（U/mL）=ΔA÷0.725÷T×103
=92×ΔA
3、細胞、細菌和組織中 LDH 活力的計算
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產生 1 nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH（U/mg prot）=[ΔA÷0.725×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103
=92×ΔA÷Cpr
需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。
（2） 按樣本鮮重計算：
單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產生1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH（U/g 鮮重）=[ΔA÷0.725×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103
=92×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH（U/104
cell）= [ΔA÷0.725×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103
=0.184×ΔA÷W
V1：加入反應體系中樣本體積，0.05mL； V2： 加入提取液體積， 1 mL； T： 反應時間， 15 min；
Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬。
