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細(xì)胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

For Research Use only

僅供研究用

貨號(hào)：QYS-239819

比色法 20T

主要用途

細(xì)胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過酪氨酸酶反應(yīng)系統(tǒng)中底物酪氨酸氧化后，產(chǎn)生多巴色素，呈現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細(xì)胞裂解懸液樣品中酶活性的經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種人體和動(dòng)物細(xì)胞，尤其是黑色素細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞裂解懸液樣品中酪氨酸酶的活性檢測，以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

酪氨酸酶（tyrosinase；EC1.14.18.1）是一種單酚單加氧酶（monophenol monooxygenase），又稱為單酚酶（monophenolase）或單酚 二羥基苯丙氨酸：O2 氧化還原酶（monophenol dihydroxyphenylalanin：O2 oxidoreductase），具有雙功能的含銅糖蛋白，廣泛存在于植物、酵母和動(dòng)物組織中，其蛋白結(jié)構(gòu)、大小、糖基化方式、激活特征等都不同。人體酪氨酸酶是一個(gè)跨膜蛋白，而催化結(jié)構(gòu)域在黑色素細(xì)胞（melanocyte）或色素細(xì)胞的黑色素器（melanosome）里。酪氨酸酶通過催化L-酪氨酸（L-tyrosine）等的o-羥基化（o-hydroxylation）反應(yīng)變成L-多巴（L-dopamine），進(jìn)而氧化產(chǎn)生黑色素底物多巴醌（dopaquinone），從而由多巴色素（dopachrome）轉(zhuǎn)化為黑色素（melanin）中的真黑素（eumelanin），以及其它色素，包括毛發(fā)和眼睛色素。紫外線可以激活酪氨酸酶活性，嚴(yán)重時(shí)，會(huì)引起色素沉著（hyperpigmentation）。酪氨酸酶基因突變將導(dǎo)致I型眼皮膚白化?。╫culocutaneous albinism）。酪氨酸酶抑制劑成為增白化妝品的重要元素。基于底物酪氨酸，在酪氨酸酶的催化下，產(chǎn)生多巴色素，通過其吸光值的變化（475nm波長），來定量測定酪氨酸酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

緩沖液（Reagent C） 毫升

底物液（Reagent D） 毫升

陰性液（Reagent E）   微升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）和底物液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。底物液（Reagent D）避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

• 樣品準(zhǔn)備 

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒QYS-237314）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好上述待測樣品，置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長475nm 
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對(duì)照測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 充入氧氣2分鐘
• 加入xx微升陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 室溫下（25℃）孵育60分鐘
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景讀數(shù)

• 樣品測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿 
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 充入氧氣2分鐘
• 加入50微升待測樣品（注意：50微克蛋白總量）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 室溫下（25℃）孵育60分鐘
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)

• 計(jì)算樣品活性

• 酶標(biāo)板測定

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到所有孔中
• 分別加入xx微升底物液（Reagent D）
• 充入氧氣2分鐘
• 分別加入xx微升陰性液（Reagent E）或待測樣品（50微克蛋白總量）
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
• 室溫下（25℃）孵育60分鐘
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測，獲得背景和樣品讀數(shù)
• 活性計(jì)算

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（酶標(biāo)板）操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 測定值由低到高變化；測定持續(xù)60分鐘 
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 樣本讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 可以使用酪氨酸酶抑制劑曲酸（Kojic acid）作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
• 酪氨酸酶單位活性定義為：在25℃，pH 6.8條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化產(chǎn)生1 微摩爾多巴色素所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列酪氨酸酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

齊一生物科技（上海）有限公司主要經(jīng)營進(jìn)口原裝Elisa試劑盒，自產(chǎn)品牌QIYBIO試劑盒，并提供免疫分析相關(guān)試劑和檢測試劑盒。種類齊全，價(jià)格實(shí)惠，凡購買我公司產(chǎn)品的新老客戶，即可享免費(fèi)代測實(shí)驗(yàn)服務(wù)，可檢測多種屬樣本。全程提供。本公司所提供的一切產(chǎn)品，僅供科研，不得用于其它用途！齊一生物科技（上海）有限公司竭誠為您服務(wù)！