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圖注：（A）Mir505 基因位于一個調(diào)控雌鼠性發(fā)育的數(shù)量性狀座位上。（B）Mir505 基因位于一個影響人類 X 染色體連鎖的垂體發(fā)育不良癥的數(shù)量性狀座位上。（C）在體外培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元中，Mir505-3p 通過抑制 Atg12 調(diào)控神經(jīng)元極性建立、軸突生長和軸突分支。（D）體內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)結(jié)果顯示，Mir505-3p 通過抑制 Atg12 促進皮層神經(jīng)元在對側(cè)腦室軸突生長和軸突分支。（E）甲苯胺藍染色指示 Mir505 敲除小鼠胼胝體處軸突發(fā)育異常。（F）透射電鏡結(jié)果顯示，Mir505 敲除小鼠皮層腦組織中自噬小體數(shù)目和面積增加，線粒體數(shù)目減少。F 圖中綠色偽彩指示自噬小體，藍色偽彩指示線粒體。（G）免疫熒光染色指示 Mir505 敲除小鼠的胼胝體、扣帶皮層和海馬傘處軸突發(fā)育異常，但扣帶皮層處成熟神經(jīng)元數(shù)目正常。（H）Mir505-3p 通過 Atg12/ 自噬通路調(diào)控神經(jīng)元軸突發(fā)育的機制圖。

8 月 19 日，細胞自噬領(lǐng)域的核心期刊《自噬》在線發(fā)表了題為《Mir505-3p 通過調(diào)控 Atg12 及自噬通路以影響神經(jīng)元軸突發(fā)育》的研究論文。該研究由東華大學化工生物學院周宇荀團隊與中國科學院上海生命科學院神經(jīng)科學研究所、腦科學與智能技術(shù)創(chuàng)新中心仇子龍研究組合作完成。該研究利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建了 Mir505 基因敲除小鼠，結(jié)合胚胎電轉(zhuǎn)技術(shù)和透射電鏡技術(shù)，報道了 Mir505-3p 基因通過靶向抑制自噬相關(guān)基因 Atg12，負向調(diào)控自噬通路并促進神經(jīng)元軸突發(fā)育的新功能。該研究提供了自噬對神經(jīng)發(fā)育調(diào)控作用的新證據(jù)?！　?/p>

“自噬”即“自我吞噬”，是一種將體內(nèi)衰老細胞器和包漿中內(nèi)含物包裹、降解并得以循環(huán)利用的途徑。自噬zui顯著的特點是需要合成名叫“自噬小體”的多層膜結(jié)構(gòu)，在這種膜結(jié)構(gòu)的包裹和呈遞下，內(nèi)含物進入溶酶體系統(tǒng)并得以降解。盡管從上世紀七十年代起，神經(jīng)元已是zui早一批用來觀察和鑒定細胞自噬超微結(jié)構(gòu)的細胞之一，但細胞自噬是如何廣泛地影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)退行性病變發(fā)生，以及如何調(diào)控軸突損傷后再生缺乏詳盡研究。近年來，關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)中細胞自噬的基礎(chǔ)與臨床研究以及自噬通路關(guān)鍵基因動物模型的研究已成為目前醫(yī)學與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)領(lǐng)域的重要課題?！　?/p>

周宇荀團隊在之前的研究中發(fā)現(xiàn)了一個與小鼠性發(fā)育相關(guān)的數(shù)量性狀座位（圖 A），并且發(fā)現(xiàn) Mir505 基因是潛在的調(diào)控者。另一項針對人 X 染色體連鎖的垂體發(fā)育不良癥的研究表明，Mir505 同樣位于調(diào)控該疾病的數(shù)量性狀座位上（圖 B）。由于哺乳動物性發(fā)育和垂體發(fā)育的本質(zhì)都是神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，因此，東華大學的科研人員試圖在神經(jīng)系統(tǒng)中考察 Mir505 基因是否影響神經(jīng)發(fā)育事件，并由此展開了與中科院神經(jīng)科學研究所仇子龍研究組的課題合作。

科研人員首先利用體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元模型驗證 Mir505 基因是否參與調(diào)控神經(jīng)元發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，Mir505 基因的一個成熟體 Mir505-3p 特異性促進神經(jīng)元極性建立、軸突生長和軸突分支，但不影響樹突發(fā)育；而另一個 Mir505 基因的成熟體則不具備這一功能?？蒲腥藛T利用胚胎電轉(zhuǎn)技術(shù)在小鼠體內(nèi)皮層組織中觀察到了同樣表型。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)并結(jié)合生物信息學預測、神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，科研人員在神經(jīng)元中篩選出 Mir505-3p 的靶基因為自噬相關(guān)基因 Atg12。Atg12 是細胞自噬通路上一個關(guān)鍵基因，其編碼的 ATG12 蛋白分子與 ATG5 蛋白和 ATG16L1 蛋白形成復合物，調(diào)控自噬小體早期形成和延伸。在本項研究之前，Atg12 是否參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育事件并不清楚。

為了研究 Atg12 對于神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育的功能，科研人員在體外培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元中分別運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電穿孔轉(zhuǎn)染兩種方式過表達 Mir505-3p 以及 Atg12，發(fā)現(xiàn) Atg12 顯著抑制神經(jīng)元極性建立、軸突生長以及軸突分支，這些現(xiàn)象與 Mir505-3p 展現(xiàn)的功能相反。并且，共轉(zhuǎn) Mir505-3p 可以恢復 Atg12 對于神經(jīng)元軸突發(fā)育的抑制效果（圖 C），這初步證實了 Atg12 抑制體外神經(jīng)元軸突發(fā)育的現(xiàn)象?？蒲腥藛T利用胚胎電轉(zhuǎn)技術(shù)觀察到，過表達 Atg12 可以恢復 Mir505-3p 對于體內(nèi)同側(cè)皮層和對側(cè)皮層神經(jīng)元軸突生長和分支的促進效果（圖 D），進一步證實了 Atg12 抑制體內(nèi)神經(jīng)元軸突發(fā)育的現(xiàn)象。

為了進一步研究 Mir505-3p 對于小鼠神經(jīng)元軸突發(fā)育是否必需，科研人員利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建了 Mir505 基因特異性敲除的基因工程小鼠。通過 HE 染色、甲苯胺藍染色（圖 E）以及免疫熒光染色（圖 G），科研人員觀察到 Mir505 敲除小鼠在胼胝體、扣帶皮層和海馬傘等軸突富集區(qū)域信號減弱，但扣帶皮層處的成熟神經(jīng)元數(shù)目沒有顯著變化（圖 G）。這提示，Mir505 基因敲除小鼠軸突信號減弱的原因并不是神經(jīng)元前體細胞增殖受干擾，而是因為 Mir505-3p 對于小鼠軸突正常發(fā)育是必需的。利用這一小鼠模型，科研人員在透射電鏡下觀察到，在 Mir505 敲除小鼠體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元和小鼠皮層組織中（圖 F）自噬小體發(fā)生顯著變化?；蚯贸∈蟮淖允尚◇w數(shù)目和面積顯著增加，而線粒體數(shù)目顯著減少。這表明，Mir505-3p 對于維持神經(jīng)系統(tǒng)正常自噬信號是必需的，敲除 Mir505 基因引起神經(jīng)系統(tǒng)中自噬通路整體激活。研究表明，軸突發(fā)育過程涉及細胞微管系統(tǒng)骨架蛋白重排、膜蛋白以及眾多極性蛋白分子的合成與轉(zhuǎn)運，這些事件的發(fā)生均依賴于神經(jīng)元充足的能量供給，因此，軸突局部的線粒體分布和線粒體移動性對于軸突生長和分支至關(guān)重要。Mir505 基因敲除小鼠神經(jīng)元胞體和軸突局部自噬小體增多并伴隨線粒體數(shù)目減少，進一步提示 Mir505-3p zui終通過自噬通路調(diào)控軸突局部線粒體分布以影響神經(jīng)元軸突發(fā)育?？蒲腥藛T在原代培養(yǎng)的 MEF 細胞中證實，Mir505-3p 通過抑制 Atg12 廣泛影響著細胞自噬通路以及線粒體數(shù)目。

此工作利用神經(jīng)元體外培養(yǎng)模型、體內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)技術(shù)、電鏡技術(shù)和基因工程小鼠模型共同鑒定了 Mir505-3p 調(diào)控神經(jīng)元軸突發(fā)育的表型，報道了 Mir505-3p 在神經(jīng)系統(tǒng)中的靶基因是自噬相關(guān)基因 Atg12，突出了 microRNA 和細胞自噬對于神經(jīng)元軸突發(fā)育的關(guān)鍵作用，提出了 Mir505-3p 通過調(diào)控 Atg12/ 自噬通路以影響軸突局部線粒體分布的全新信號通路及其分子機制（圖 H），對深入理解自噬通路對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控有重要意義。