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1月8日，生命中心施一公研究組在《科學(xué)》（Science）就剪接體的結(jié)構(gòu)與機(jī)理研究再發(fā)長(zhǎng)文（Research Article），題為《U4/U6.U5 三小核核糖核蛋白復(fù)合物3.8埃的結(jié)構(gòu)：對(duì)剪接體組裝及催化的理解》（The 3.8 A Structure of the U4/U6.U5 tri-snRNP: Insights into Spliceosome Assembly and Catalysis），報(bào)道了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）剪接體組裝過程中的一個(gè)關(guān)鍵復(fù)合物U4/U6.U5 tri-snRNP高達(dá)3.8埃分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并在此基礎(chǔ)上分析了剪接體的組裝機(jī)制，為進(jìn)一步理解剪接體的激活及前體信使RNA（pre-mRNA）剪接反應(yīng)的催化機(jī)制提供了重要分子基礎(chǔ)。該結(jié)構(gòu)與2015年8月施一公研究組報(bào)道的分辨率為3.6埃的裂殖酵母（Schizosaccharomycs pombe）剪接體結(jié)構(gòu)的對(duì)比揭示了剪接體在pre-mRNA剪接反應(yīng)過程中作為核酶（ribozyme）的催化本質(zhì)，是RNA剪接研究領(lǐng)域的又一重大進(jìn)展。

剪接體作為真核細(xì)胞中催化pre-mRNA剪接過程的執(zhí)行者，是真核生物zui基本的分子機(jī)器之一，對(duì)于正常生命活動(dòng)具有至關(guān)重要的作用?；虻腻e(cuò)誤剪接或剪接體的錯(cuò)誤調(diào)控與許多疾病相關(guān)。在剪接反應(yīng)過程中，組成剪接體的大量蛋白質(zhì)和核酸分子按照高度的順序進(jìn)行結(jié)合和解聚，在此過程中伴隨大規(guī)模的結(jié)構(gòu)重組，依次組裝成命名為E、A、B、Bact、B*、C、P、ILS等等的一系列大分子復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)含子與外顯子交界位點(diǎn)的識(shí)別，以及內(nèi)含子的切除和外顯子的拼接。在近二百種剪接體組分中，U6小核RNA（snRNA）包含對(duì)于剪接反應(yīng)具有直接催化活性的尿嘧啶核糖核苷酸（Uridine）。該核苷酸是如何在起始時(shí)被保護(hù)從而處于失活構(gòu)象、又如何在適當(dāng)時(shí)機(jī)被釋放激活從而行使催化功能，是揭示剪接體工作機(jī)理的核心問題之一。剪接體成分復(fù)雜多變、構(gòu)象高度動(dòng)態(tài)，所以對(duì)于剪接體組裝及催化過程中各復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究是zui基礎(chǔ)也是zui富挑戰(zhàn)性的生物學(xué)難題之一。

圖1 U4/U6.U5 tri-snRNP電鏡密度及三維結(jié)構(gòu)示意圖。

U4/U6.U5 tri-snRNP是剪接體組裝過程中zui大也是zui保守的預(yù)組裝復(fù)合物，它由U5小核核糖核蛋白（snRNP），U4、U6 snRNA和其他蛋白因子組成。在該復(fù)合物中，U6 snRNA呈現(xiàn)失活構(gòu)象。U4/U6.U5 tri-snRNP與A復(fù)合物結(jié)合形成B復(fù)合物，再經(jīng)過一系列成分、構(gòu)象重組后，U1、U4 snRNP解離，剪接體形成，U6 snRNA從而被激活。所以，tri-snRNP的加入是組裝成具有催化活性的剪接體這個(gè)過程中*的一步，其高分辨率結(jié)構(gòu)的解析對(duì)于揭示pre-mRNA剪接反應(yīng)的分子機(jī)理至關(guān)重要。早期對(duì)于該復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究分辨率較低，僅有2納米，除了顯示一個(gè)三角形的外觀之外基本不能提供更多信息。2015年6月，英國(guó)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室Nagai研究組利用冷凍電鏡將其分辨率提高至5.9 埃，定位出多個(gè)組分，顯示了一些二級(jí)結(jié)構(gòu)，但由于分辨率所限，仍不足以搭建原子模型。

在施一公研究組發(fā)表的《科學(xué)》論文中，他們探索并優(yōu)化了蛋白提純方案，獲得了性質(zhì)良好的釀酒酵母U4/U6.U5 tri-snRNP復(fù)合物的蛋白樣品，并利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)重構(gòu)出了總體分辨率為3.8埃的三維結(jié)構(gòu)，核心區(qū)域分辨率更是高達(dá)3.0-3.5埃，從而將該復(fù)合物分辨率推進(jìn)至近原子分辨率，并搭建了該復(fù)合物的原子模型（圖1）。該結(jié)構(gòu)清晰顯示由于U6與U4 snRNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)作用和蛋白因子Prp3的保護(hù)作用，U6 snRNA中的催化核苷酸Uridine 80被穩(wěn)定在失活構(gòu)象。

圖2 pre-mRNA與tri-snRNP結(jié)合。

在此高分辨率的結(jié)構(gòu)中，一個(gè)出人意料的發(fā)現(xiàn)是U4/U6.U5 tri-snRNP復(fù)合物中存在著與之結(jié)合的pre-mRNA。該pre-mRNA通過與U5 snRNA和U6 snRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)被識(shí)別，其5’剪接位點(diǎn)中高度保守的鳥嘌呤核糖核苷酸（Guanine）被關(guān)鍵蛋白Prp8特異性識(shí)別。這一發(fā)現(xiàn)為剪接體的組裝和剪接反應(yīng)的催化提供了新的見解（圖2）。

醫(yī)學(xué)院三年級(jí)博士生萬蕊雪、清華大學(xué)生命學(xué)院博士后閆創(chuàng)業(yè)為本文共同*作者；醫(yī)學(xué)院一年級(jí)博士生白蕊和生命學(xué)院二年級(jí)博士生王琳參與樣品制備和數(shù)據(jù)收集；施一公為通訊作者。中科院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所黃超蘭研究員與黃敏參與樣品質(zhì)譜鑒定的合作。電鏡數(shù)據(jù)采集于清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)，計(jì)算工作得到清華大學(xué)高性能計(jì)算平臺(tái)、國(guó)家蛋白質(zhì)設(shè)施實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心(北京)以及聯(lián)想高性能計(jì)算的支持。本工作獲得了北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心及國(guó)家自然科學(xué)基金委的經(jīng)費(fèi)支持。

相關(guān)論文鏈接：

1、《U4/U6.U5 三小核核糖核蛋白復(fù)合物3.8埃的結(jié)構(gòu)：對(duì)剪接體組裝及催化的理解》

2、《3.6埃的酵母剪接體結(jié)構(gòu)》

3、《前體信使RNA剪接的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)》

4、《Lsm蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)合U6小核RNA 3’末端序列的晶體結(jié)構(gòu)》