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細(xì)胞融合(cell fusion)主要方法和操作步驟

2015-6-12  閱讀(561)

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兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的現(xiàn)象稱為細(xì)胞融合,也稱細(xì)胞雜交,在自然情況下的受精過(guò)程即屬這種現(xiàn)象。
誘導(dǎo)細(xì)胞融合的主要方法有:病毒誘導(dǎo)融合,化學(xué)融合劑誘導(dǎo)融合和電融合。
1. 病毒誘導(dǎo)融合:有許多種類的病毒能介導(dǎo)細(xì)胞融合,zui常用的是滅活的仙臺(tái)病毒(HVJ),為RNA病毒。病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的過(guò)程有:首先是細(xì)胞表面吸附許多病毒粒子,接著細(xì)胞發(fā)生凝集,幾分鐘至幾十分鐘后,病毒粒子從細(xì)胞表面消失,而就在這個(gè)部位鄰接的細(xì)胞的細(xì)胞膜融合,胞漿相互交流,zui后形成融合細(xì)胞。
2. 化學(xué)融合劑誘導(dǎo)融合:化學(xué)融合劑主要有脂肪酸衍生物、脂質(zhì)體、鈣離子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白質(zhì)和多肽,其中zui常用的是聚已二醇(PEG)。PEG用于細(xì)胞融合至少有兩方面的作用:①可促使細(xì)胞凝結(jié);②破壞互相接觸處的細(xì)胞膜的磷脂雙分子層,從而使相互接觸的細(xì)胞膜之間發(fā)生融合,進(jìn)而細(xì)胞質(zhì)溝通,形成一個(gè)打的雙核或多核融合細(xì)胞。
3. 電融合:是指細(xì)胞在電場(chǎng)中極化成偶極子,并沿著電力線排列成串,然后用高強(qiáng)度、短時(shí)程的電脈沖擊穿細(xì)胞膜而導(dǎo)致細(xì)胞融合。
細(xì)胞融合技術(shù)在基因定位、基因表達(dá)產(chǎn)物、腫瘤診斷核治療、生物新品種培育及單克隆抗體技術(shù)等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用前景。單克隆抗體技術(shù)就是通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展起來(lái)的,在生命科學(xué)研究核應(yīng)用方面產(chǎn)生了重大影響。

實(shí)驗(yàn)操作
在公雞翼下靜脈抽取2ml雞血,加入盛有8ml的Alsever液中,使血液與Alsever液的的比例達(dá)1∶4,混勻后可在冰箱中存放一周;
取此儲(chǔ)存雞血0.2ml加入0.8ml的0.85%生理鹽水,充分混勻,1500r/min離心5min,棄去上清,加入1ml的0.85%生理鹽水,重復(fù)上述條件離心兩次。zui后棄去上清,加GKN液0.8ml,離心;
棄去上清,加入0.3ml的GKN溶液,制成細(xì)胞懸液;(也可以用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),用GKN液將其調(diào)整為106個(gè)/ml);
取以上細(xì)胞懸液0.2ml放入1ml的EP管中,然后放入37℃水浴中預(yù)熱,同時(shí)將50%PEG液一并預(yù)熱20min;
20min后將0.2ml的50%PEG溶液逐滴沿離心管壁加入到0.2ml細(xì)胞懸液中,邊加邊搖勻,然后放入37℃水浴中保溫20min;
20min后,加入GKN溶液1ml,靜止于水浴中20min左右;
1500r/min離心5min,棄去上清,加GKN溶液再離心1次;
棄去上清,加入GKN液少許,混勻,取少量懸浮于載玻片上,加入詹納斯綠染液,用牙簽混勻,3min蓋上蓋玻片,觀察細(xì)胞融合情況。

融合過(guò)程

相關(guān)實(shí)驗(yàn)溶液的配制
Alsever溶液:葡萄糖2.05g,檸檬酸鈉0.80g,NaCl 0.42g,溶于100ml雙蒸水中。
GKN溶液:NaCl 8g,KCl 0.4g,Na2HPO4·2H2O 1.77g,NaH2PO4·H2O 0.69g,葡萄糖2g,酚紅0.01g,溶于1000ml水中。
50%PEG溶液:稱取一定量的PEG(WM=4000)放入燒杯中,沸水浴加熱,使之熔化,待冷卻至50℃時(shí),加入等體積預(yù)熱至50℃的GKN溶液,混勻,置37備用。

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