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細胞實驗知識-正常細胞與腫瘤細胞常規(guī)核型的標(biāo)本制備

【實驗?zāi)康摹?/span>

掌握微量全血培養(yǎng)及正常細胞和腫瘤細胞常規(guī)核型的標(biāo)本制備技術(shù)。了解正常及腫瘤

細胞核型的一般特征。

【實驗用品】

一、材料和標(biāo)本 健康人的外周血、培養(yǎng)的 HeLa 細胞和 HL—60 細胞。

二、器材和儀器 超凈臺、煤氣燈、乳膠管、火柴、鑷子、廢液缸、離心機、水浴箱、

定時鐘、天平、離心管（10m1）、乳頭吸管、顯微鏡、載玻片、平皿等。無菌器材有培養(yǎng)瓶、

培養(yǎng)皿、注射器（5ml、lml）、注射針頭、刻度移液管（5ml、2ml、lml）、吸管等。

三、試劑 1640 培養(yǎng)液、500 單位／ml 的肝素溶液、10μg／ml 的秋水仙素溶液、0.25

％胰蛋白酶一 0.02％EDTA 混合消化液,O．5mg／ml 的 PHA 溶液、0.075mol／L 的 KCl 溶液，

甲醇、冰醋酸、Giemsa 原液、磷酸緩沖液（pH6.8）、生理鹽水等。

【實驗內(nèi)容】

一、微量全血培養(yǎng)

（一）原理

人體外周血中淋巴細胞是成熟的免疫細胞，正常情況下處于 G。期不再增殖。

PHA（Phytohemagglutinin，植物血凝素）是人和其它動物淋巴細胞的有絲分裂刺激劑，它能

使處于 G0 期的淋巴細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，進入細胞周期開始旺盛的有絲分裂。

人體微量全血培養(yǎng)是一種簡單的淋巴細胞培養(yǎng)方法。此法采血量少、操作簡便，在 PHA

作用下進行短期培養(yǎng)即可獲豐富的、有絲分裂活躍的淋巴母細胞，適于制備核型標(biāo)本。各

種因素的效應(yīng)（如病毒、電離輻射、化學(xué)藥劑等）也可在淋巴細胞的培養(yǎng)條件下進行觀察，

從而進行多種在體內(nèi)無法進行的研究。因此它是細胞生物學(xué)及其它學(xué)科研究中的一種有效

的方法。

（二）操作

1．打開超凈臺紫外燈 20～30 分鐘。洗手、換潔凈白大衣后進入操作室。啟動超凈臺，

點燃煤氣燈。用 75％酒精棉球擦洗手、各種試劑瓶及操作臺面，然后將培養(yǎng)液及肝素、秋

水仙素、PHA 等所需溶液移入超凈臺。

2．在超凈臺內(nèi)將每個培養(yǎng)瓶裝入 5ml 培養(yǎng)液及 0.2ml PHA 溶液，封好備用。

3．用 5ml 注射器，7 號針頭，先吸取少許肝素濕潤針筒，然后從肘靜脈抽血 l～2ml。

每個培養(yǎng)瓶接種全血 O．2ml 左右輕輕搖動使血和培養(yǎng)液混勻。

4．在培養(yǎng)瓶上標(biāo)記好供血者姓名、性別、采血日期等，放入培養(yǎng)箱中 37℃培養(yǎng)。每天

輕輕震蕩培養(yǎng)瓶二、三次，防止血球沉積并保證血細胞與培養(yǎng)液充分接觸，促進細胞生長

繁殖。

二、人淋巴細胞染色體標(biāo)本制備

（一）原理

在淋巴母細胞分裂高峰時加入秋水仙素，破壞細胞紡錘體的形成，使細胞停止在分裂

中期。然后收集細胞，低滲處理，使細胞脹大，染色體伸展。接著進行固定并除去中期分

裂相中殘存的蛋白質(zhì)，使染色體清晰且分散良好。再結(jié)合離心技術(shù)去掉紅細胞碎片，然后

采用空氣干燥法制片獲得中期染色體標(biāo)本。

（二）操作

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1．微量全血細胞培養(yǎng)至 68 小時左右，用 1ml 注射器針頭向每個 5ml 培養(yǎng)瓶內(nèi)加 2 滴

秋水仙素溶液，搖勻后繼續(xù)培養(yǎng) 3 小時，此項操作不需要嚴格無菌。

2．按時終止培養(yǎng)，用吸管溫和吹打成細胞懸液后，移至 10ml 離心管中。用天平平衡

后以 1000rpm 離心 8 分鐘，棄大部上清，剩 0.5ml。再吹打成細胞懸液，加入預(yù)熱 37℃的

0.075mol／L 的 KCL 溶液 9ml，置 37℃水浴中低滲處理 30 分鐘（這期間配制 3:1 甲醇一冰醋

酸固定液）。

3.向離心管中加入 1ml 固定液預(yù)固定。平衡后以 1000rpm 離心 8 分鐘，同樣剩 0.5ml

上清。

4．輕輕將細胞吹成懸液，加 5~6ml 固定液，室溫下固定 30 分鐘。然后離心，棄上清，

重復(fù)固定一次。再離心，留 0.1～0.2ml 上清，吹打成細胞懸液。

5．吸取 1～2 滴懸液，在距載片約 15cm 高度滴于預(yù)冷的干凈載玻片上，迅速對準(zhǔn)細胞

吹氣促進染色體分散。斜放載玻片，在空氣中晾干（此期間配制 Giemsa 染液，Giemsa 原液

和磷酸緩沖液 1:10）。

6．將標(biāo)本面朝下放在染色槽中，加入染液染 10 分鐘，自來水沖洗，晾干后觀察。

（三）結(jié)果

低倍鏡下，制片質(zhì)量較好的標(biāo)本上可看到有較多的分裂相，染色體之間分散良好，互

不重疊。

油鏡下觀察可見每一條染色體都含有兩條染色單體，兩條單體由著絲粒相結(jié)。分區(qū)計

數(shù)染色體數(shù)目并判定性別，或拍照后進行核型分析。

三、腫瘤細胞的染色體標(biāo)本制備

（一）原理

利用腫瘤細胞無限繁殖的特點，掌握其體外生長動態(tài)，取處于對數(shù)生長期的細胞便可

獲得豐富的分裂相。腫瘤細胞染色體異常包括兩個方面：

1．結(jié)構(gòu)異常 即在腫瘤細胞常出現(xiàn)的染色體畸變，包括雙著絲點染色體、環(huán)狀染色體、

斷裂的染色體、染色體裂隙及微小體等。

2．?dāng)?shù)目異常 由于腫瘤細胞分裂失去應(yīng)有的調(diào)控，可出現(xiàn)亞二倍體、超二倍體和多一

倍體數(shù)目異常現(xiàn)象。

腫瘤細胞染色體制備技術(shù)在細胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床診斷、愈后觀

察等方面均有廣泛用途。

（二）操作

l．以 1.6× 10 5 個／ml 細胞濃度將 FL—60 細胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，48 小時后以終濃度

為 0.04μg／ml 的秋水仙素處理 2.5 小時，移入 10ml 離心管。其余步驟與淋巴細胞染色體

制備相同。

2.將長成單層的 HeLa 細胞按 1:2 傳代進行培養(yǎng)，36 小時后用終濃度為 0.04μg／ml

的秋水仙素處理 3 小時。按時終止培養(yǎng)，用 0.25％胰蛋白酶一 0.02％EDTA 混合消化液處理

單層細胞，待細胞收縮變圓時，棄去消化液。加入少許低滲液將細胞從瓶壁洗脫，移入 10ml

離心管，加入預(yù)熱 37℃的低滲液至 5 ~ 6ml，在 37℃處理 25 分鐘。以下步驟同淋巴細胞染

色體核型制備。

（三）結(jié)果

計數(shù) HeLa 細胞和 HL—60 細胞的染色體數(shù)并尋找是否有畸變的染色體。

附：人體染色體常規(guī)核型的分析

一、人體染色體的觀察

取制備較好的染色體玻片標(biāo)本，先在低倍鏡下觀察。在標(biāo)本中選擇一個染色體之間分散

較好，互不重疊的中期分裂相，置于視野*，然后換油鏡仔細觀察。每個染色體都含有

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兩條染色單體，兩單體連接處為著絲粒。計數(shù)時要把分散的染色體劃分為幾個區(qū)域以免計

數(shù)重復(fù)或遺漏，然后計數(shù)并判定性別。

二、核型分析的方法

人體染色體常規(guī)核型的分析，在今天的染色體研究水平上作為染色體結(jié)構(gòu)異常的疾病

診斷已經(jīng)失去意義，但對染色體數(shù)目異常仍具有診斷上的價值，尤其是起著分析其它幾種

顯帶核型的橋梁作用。通過常規(guī)核型的分析必須掌握三點：（一）會分組、（二）了解各組染

色體的基本形態(tài)特征、（三）會計數(shù)數(shù)目和鑒定性別。

人體染色體的常規(guī)核型即按照 Denver 會議（1960 年）提出的染色體命名和分類標(biāo)準(zhǔn)，將

人類體細胞的 46 條染色體按大小、著絲點的位置分成七組（A、B、C、D、E、F、G、）23 對

的排列。

七組染色體的基本形態(tài)特征及分析順序是：

A 組是七組染色體中zui大的一組，首先找出它。A 組包括三對，即第 1~3 號 6 條染色體，

第 1 號為zui大、是*著絲點，長臂近側(cè)有次縊痕；第 2 號第二大、著絲點略偏離*；

第 3 號為三大，是*著絲點。

接著確定 B 組：B 組二對即第 4～5 號 4 條染色體，較大，均為亞中著絲點，兩者不易

區(qū)分開。

第三確定 D 組和 G 組：D 組三對即第 13～15 號 6 條染色體，中等大小均為近端著絲點，

短臂末端有隨體。G 組二對即第 21～22 號 4 條染色體，是zui小的一組，均為近端著絲點，

短臂末端有隨體，長臂常呈分叉狀，21 號稍小于 22 號。Y 染色體被隸屬于該組，短臂無隨

體，一般較 2l、22 號大點。

第四確定 F 組：F 組二對即第 19～20 號 4 條染色體，染色體比 G 組稍大、均為*著

絲點。

染色體分組形態(tài)特征表

第五確定 E 組：E 組三對即第 16～18 號 6 條染色體，較小，第 16 號是*著絲點，17、

18 號是亞中著絲點。

余者為 C 組：C 組七對即第 6～12 號 14 條染色體，按大小順序依次排列，均是亞中著

絲點；X 染色體被隸屬該組，大小居 6～7 號之間，是亞中著絲點。

上述人的常規(guī)核型中，1～22 號為常染色體，男女共有，另一對為性染色體，決定性別，

男性為 XY，女性為 XX，人的正常核型寫法：男 46，XY；女 46，XX。