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正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

ICDHc（EC 1.1.1.42）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化異檸檬酸脫氫脫羧生成 α-酮戊二酸，同時(shí)還原NADP+生成NADPH。ICDHc是細(xì)胞質(zhì)中除了磷酸戊糖途徑外又一種NADPH重要來源，在逆境中該酶活性通常會(huì)發(fā)生顯著變化。

測(cè)定原理：

利用ICDHc催化NADP+還原成NADPH反應(yīng)，在340 nm下測(cè)定NADPH濃度的增加。

所需的儀器和用品:

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存； 

試劑一：液體19 mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存；

樣本的前處理： 

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解；在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑一，混勻后立即記錄340nm處20s后吸光值A(chǔ)1和 2min20s后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意事項(xiàng)：

1. 若A2-A1大于0.5，需將酶液用提取液稀釋，使A2-A1小于0.5，可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

2. 若A2-A1小于0.005，可延長反應(yīng)時(shí)間到5min或10min。

ICDHc活力單位的計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）ICDHc活力的計(jì)算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICDHc（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=1608×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中ICDHc活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICDHc（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICDHc（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1608×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICDHc（nmol/min/104）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=3.216×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）ICDHc活力的計(jì)算：

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICDHc（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=3216×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中ICDHc活力的計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICDHc（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICDHc（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)  ÷T=3216×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICDHc（nmol/min/104）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=6.432×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

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