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注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

生物體內(nèi)巰基主要包括巰基和蛋白質(zhì)巰基。前者不僅能夠修復(fù)氧化損傷的蛋白質(zhì)，而且參與活性氧清除，后者對于維持蛋白質(zhì)構(gòu)象具有重要作用。通過測定總巰基含量和GSH含量，能夠間接測定蛋白質(zhì)巰基含量。

測定原理：

巰基基團與5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色化合物，在412nm處有最大吸收峰。

自備實驗用品：

天平、研缽、恒溫水浴鍋、酶標(biāo)儀、96孔板、乙醇和蒸餾水。

試劑組成和配制： 

試劑一：液體18mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體1mL×1管，4℃避光保存。 

樣品的制備：

1. 按照組織質(zhì)量（g）：水體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL蒸餾水）進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 血清，培養(yǎng)液：稀釋5倍后測定，可取0.1mL樣本，加入0.4mL蒸餾水，混勻，置冰上待測。

操作步驟：

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至412nm。

2. 操作表

在96孔板中加入如下試劑

計算公式：

總巰基標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.8111x - 0.0037，R2 = 1，x為標(biāo)品濃度，單位μmol/mL，y為吸光度ΔA。

1. 組織：

（1）按樣本重量計算

總巰基含量（μmol/g 鮮重）=（ΔA+0.0037）÷1.8111×V樣總÷W

=0.552×（ΔA+0.0037）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算

總巰基含量（μmol/mg prot）=（ΔA+0.0037）÷1.8111×V樣總÷Cpr

=0.552×（ΔA+0.0037）÷Cpr

2. 血清、培養(yǎng)液：

總巰基含量（μmol/L）=（ΔA+0.0037）÷1.8111×5×103

=2761×（ΔA+0.0037）

V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g ；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；5：血清，培養(yǎng)液等液體樣本稀釋倍數(shù)；103 ：1mmol/ L=103μmol/ L

注意事項

檢出限為10μmol/L。

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