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正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

H2O2是生物體內(nèi)最常見的活性氧分子，主要由SOD和XOD等催化產(chǎn)生，由CAT和POD等催化降解。H2O2不僅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互轉(zhuǎn)化的樞紐。一方面，H2O2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細(xì)胞膜遭受損害，從而加速細(xì)胞的衰老和解體；另一方面H2O2也是許多氧化應(yīng)急反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，。

測定原理：

H2O2與硫酸鈦生成黃色的過氧化鈦復(fù)合物，在415nm有特征吸收。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、丙酮100mL、濃鹽酸5mL、研缽和冰。

試劑的組成和配制：

試劑一：丙酮100mL×1瓶，4℃保存；（自備）

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入3mL濃鹽酸充分溶解備用。用不完的試劑4℃保存；(溶解時間較長，約30min，可40℃-60℃加熱，務(wù)必提前準(zhǔn)備)

試劑三：液體10mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：液體30mL×1瓶，4℃保存；

H2O2提?。?strong> 

1、細(xì)菌或細(xì)胞樣品的制備：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；用試劑一定容至1mL；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 組織樣品的制備：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿；轉(zhuǎn)移至EP管中，用試劑一定容至1mL，8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟

1. 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至415nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 將試劑二、三和四37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

3. 在EP管中按順序加入下列試劑

4000g，25℃離心10min，棄上清，留沉淀

加入試劑四溶解沉淀后，室溫靜置5min，取200μL轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或96孔板中測定415nm處吸光值A(chǔ)。對照管只要做一次即可。計算ΔA＝A測定-A對照。

注意事項：

1、由于試劑一易揮發(fā)，試劑一必須先預(yù)冷再加，研磨時必須在冰上研磨。

2、本試劑盒中試劑的揮發(fā)性較高，請帶一次性手套和口罩。

H2O2含量計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸曲線，y = 0.7488x + 0.0006 (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL；y為ΔA)。

2、血清（漿）中H2O2含量的計算：

H2O2含量（μmol/mL）＝(ΔA-0.0006) ÷0.7488=1.34×(ΔA-0.0006)

3、細(xì)菌、細(xì)胞或動物組織中H2O2含量計算

（1）按照蛋白濃度計算

H2O2含量(μmol/mg prot)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(V1×Cpr)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按照樣本質(zhì)量計算

H2O2含量(μmol/g鮮重)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(W ×V1÷V2)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷W

 (3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

H2O2含量(μmol/104)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0027×(ΔA-0.0006)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25mL；V2：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸曲線，y = 0.3744x + 0.0006  (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL；y為ΔA)。

2、血清（漿）中H2O2含量的計算：

H2O2含量（μmol/mL）＝(ΔA-0.0006)÷0.3744=2.67×(ΔA-0.0006)

3、細(xì)菌、細(xì)胞或組織中H2O2含量計算

（1）按照蛋白濃度計算

H2O2含量(μmol/mg prot)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(V1×Cpr)=2.67×(ΔA-0.0006) ÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按照樣本質(zhì)量計算

H2O2含量(μmol/g鮮重)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(W ×V1÷V2)= 2.67×(ΔA-0.0006) ÷W

 (3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

H2O2含量(μmol/104)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(500×V1÷V2)= 0.0054×(ΔA-0.0006)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25mL；V2：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。

注意：標(biāo)曲線性范圍為0.1μmol/mL-2μmol/mL，吸光度ΔA線性范圍為0.03-1，若ΔA超過1則需要稀釋，計算公式乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

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