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測(cè)定意義

SBE（EC 2.4.1.18）主要存在于植物中，是參與支鏈淀粉合成的關(guān)鍵酶，測(cè)定SBE活性在淀粉生物合成、優(yōu)質(zhì)農(nóng)作物品種選育和品質(zhì)遺傳改良研究中具有重要意義。

測(cè)定原理

直鏈淀粉和碘結(jié)合后在660nm有特征光吸收，SBE使直鏈淀粉含量減少，從而降低了淀粉-碘復(fù)合物在660nm吸收值，一定時(shí)間內(nèi)吸光度下降的百分率可以反映SBE活性。

需自備的的儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水

試劑的組成和配制

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體10mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1支，4℃保存；臨用前每支加入1mL蒸餾水，95℃沸水浴充分溶解后備用；用不完的試劑4℃保存；

試劑三：液體13mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：液體1mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取 

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到660 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表

混勻，37℃準(zhǔn)確保溫20 min，置95℃水浴中5 min（蓋緊，防止水分散失），冷卻

混勻，室溫靜置10min，取200uL至微量石英比色皿或96孔板中，660nm處讀取各管吸光值。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)個(gè)一個(gè)對(duì)照管。

注意：

1、可以在不同對(duì)照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進(jìn)行5min 95℃沸水浴處理。2、試劑二如有沉淀，務(wù)必沸水浴溶解后使用。

SBE活力單位的計(jì)算

1、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：以波長(zhǎng)660nm的吸光度下降百分率表示，每mg蛋白在反應(yīng)體系中每降低1％碘藍(lán)值為一個(gè)酶活性單位。

SBE活性(U/mg prot)=( A對(duì)照管-A測(cè)定管)/A對(duì)照管÷Cpr ×100

2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：以波長(zhǎng)660nm的吸光度下降百分率表示，每g組織在反應(yīng)體系中每降低1％碘藍(lán)值為一個(gè)酶活性單位。

SBE活性(U/g 鮮重)=(A對(duì)照管-A測(cè)定管)/A對(duì)照管÷(W÷V樣總)×100

V樣總：提取液總體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g。

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