人組織蛋白酶C（Cathepsin C，CTSC，也被稱為二肽基肽酶I）是溶酶體半胱氨酸蛋白酶家族的核心成員，在免疫細(xì)胞激活、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等生理病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。本試劑盒為?科研專用雙抗體夾心法ELISA檢測(cè)工具?，可精準(zhǔn)定量人源生物樣本中的CTSC蛋白含量，不可直接用于臨床診斷場(chǎng)景，以下為你提供覆蓋全流程的詳細(xì)說明：

t核心檢測(cè)原理

試劑盒采用經(jīng)典的雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附體系：預(yù)先將高特異性的抗人CTSC單克隆捕獲抗體包被在96孔微孔板表面，實(shí)驗(yàn)過程中依次加入待測(cè)樣本、梯度標(biāo)準(zhǔn)品和HRP直接標(biāo)記的CTSC檢測(cè)抗體，經(jīng)過恒溫孵育后，在微孔板表面形成“捕獲抗體-CTSC靶蛋白-HRP標(biāo)記檢測(cè)抗體"的特異性三明治免疫復(fù)合物。

經(jīng)過多次充分洗板洗去所有未結(jié)合的游離組分后，加入TMB顯色底物，TMB在HRP過氧化物酶的催化作用下逐步轉(zhuǎn)化為藍(lán)色反應(yīng)產(chǎn)物，最終加入酸性終止液將反應(yīng)終止，藍(lán)色產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的黃色。最終反應(yīng)體系的黃色深淺與樣本中CTSC蛋白的實(shí)際含量呈嚴(yán)格的正相關(guān)關(guān)系，通過酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度OD值，即可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線精準(zhǔn)計(jì)算出樣本中CTSC的實(shí)際濃度。

?基礎(chǔ)產(chǎn)品參數(shù)與市場(chǎng)規(guī)格

目前國(guó)內(nèi)主流科研試劑廠商的人CTSC ELISA試劑盒已經(jīng)形成標(biāo)準(zhǔn)化的產(chǎn)品體系，核心參數(shù)高度統(tǒng)一：

★試劑盒完整組分清單

96孔標(biāo)準(zhǔn)配置的試劑盒標(biāo)配所有實(shí)驗(yàn)所需試劑，無需額外配制特殊緩沖液，開箱即可直接開展實(shí)驗(yàn)：

l 預(yù)包被CTSC特異性捕獲抗體的96孔可拆酶標(biāo)板條（12孔×8條），未使用完的板條密封后可在2~8℃干燥環(huán)境中額外保存1個(gè)月

l 梯度凍干CTSC標(biāo)準(zhǔn)品6管，每管0.3mL，復(fù)溶后可直接用于倍比稀釋，剩余標(biāo)準(zhǔn)品分裝后置于-20℃可長(zhǎng)期保存6個(gè)月

l 樣本專用稀釋液6mL，適配各類復(fù)雜基質(zhì)樣本，大幅降低血清、血漿中的非特異性蛋白干擾

l HRP直接標(biāo)記的CTSC檢測(cè)抗體10mL，無需額外添加生物素-鏈霉親和素體系，簡(jiǎn)化操作流程

l 20×濃縮洗滌緩沖液25mL，用蒸餾水按1:20比例稀釋后即可使用，低溫下析出的鹽結(jié)晶37℃水浴助溶后不影響使用效果

l TMB底物A液6mL、TMB底物B液6mL，按1:1混合后即可用于顯色，全程避光保存

l 2mol/L硫酸終止液6mL，用于終止酶促顯色反應(yīng)，操作時(shí)需佩戴防護(hù)手套避免直接接觸皮膚

l 封板膜2張、自封袋1個(gè)、紙質(zhì)產(chǎn)品說明書1份

★樣本前處理專屬規(guī)范

CTSC本身是活性jiqiang的溶酶體半胱氨酸蛋白酶，樣本處理不規(guī)范會(huì)直接導(dǎo)致靶蛋白降解、酶活性異常，最終檢測(cè)結(jié)果大幅失真，必須嚴(yán)格遵循以下專屬操作要求：

1、血清樣本?：靜脈采血后立即置于無抗凝劑的真空采血管中，室溫自然凝固30分鐘，或4℃條件下過夜凝固，2~8℃ 1000×g離心20分鐘，小心吸取上層清亮血清，絕對(duì)避免吸入下層血細(xì)胞沉淀，溶血樣本嚴(yán)禁用于檢測(cè)，紅細(xì)胞破裂釋放的大量?jī)?nèi)源性蛋白酶會(huì)直接降解CTSC靶蛋白，導(dǎo)致結(jié)果系統(tǒng)性偏低。分裝后的血清置于-20℃或-80℃凍存，?嚴(yán)格禁止反復(fù)凍融超過2次?，反復(fù)凍融過程中蛋白三維結(jié)構(gòu)破壞，抗原表位丟失，檢測(cè)結(jié)果偏差可超過30%。

2、血漿樣本?：采血后立即注入EDTA或肝素抗凝管中，采集后30分鐘內(nèi)2~8℃ 1000×g離心15分鐘，小心吸取上層血漿，可在樣本中提前加入適量半胱氨酸蛋白酶抑制劑，抑制樣本中內(nèi)源性CTSC的酶活性，避免靶蛋白發(fā)生自降解。注意檸檬酸鹽抗凝血漿未經(jīng)過通用驗(yàn)證，使用前必須自行驗(yàn)證基質(zhì)兼容性，疊氮鈉（NaN?）濃度>0.1%的樣本絕對(duì)不能使用，其會(huì)不可逆地抑制HRP酶活性，直接導(dǎo)致顯色失敗。

3、組織勻漿樣本?：新鮮離體組織用預(yù)冷的0.01mol/L pH7.4 PBS緩沖液反復(fù)沖洗，去除殘留血液，按1g組織對(duì)應(yīng)9mL預(yù)冷PBS的比例加入緩沖液，?必須在PBS中提前添加足量的蛋白酶抑制劑?，冰上充分研磨勻漿，可輔助超聲破碎進(jìn)一步釋放細(xì)胞溶酶體內(nèi)的CTSC蛋白，5000×g 4℃離心10分鐘，取澄清上清待測(cè)，避免勻漿中殘留的細(xì)胞碎片引入非特異性干擾。

4、細(xì)胞培養(yǎng)上清/細(xì)胞裂解液樣本?：細(xì)胞培養(yǎng)上清收集后1000×g離心20分鐘，去除懸浮細(xì)胞和細(xì)胞碎片，立即檢測(cè)或分裝后-20℃凍存；細(xì)胞裂解液采用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解30分鐘，12000×g 4℃離心15分鐘取上清，BCA定量總蛋白后再進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)，便于不同組間的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化校正。

?標(biāo)準(zhǔn)化詳細(xì)操作步驟

所有試劑提前從2~8℃冰箱取出，室溫平衡60分鐘后再開始實(shí)驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本全部建議設(shè)置復(fù)孔，zuida程度降低移液操作帶來的隨機(jī)誤差：

1、板條準(zhǔn)備?：從鋁箔袋中取出本次實(shí)驗(yàn)所需數(shù)量的酶標(biāo)板條，剩余未使用的板條立即放回原自封袋中密封，重新置于2~8℃干燥環(huán)境保存。

2、標(biāo)準(zhǔn)品梯度配制?：向凍干CTSC標(biāo)準(zhǔn)品管中加入對(duì)應(yīng)體積的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，充分溶解后靜置10分鐘，得到20ng/mL的最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品，隨后通過倍比稀釋依次得到10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL共6個(gè)梯度濃度，零濃度孔直接用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液作為空白對(duì)照。

3、上樣加樣?：設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加入不同梯度濃度的CTSC標(biāo)準(zhǔn)品50μL，待測(cè)樣本孔先加入40μL樣本稀釋液，再加入10μL預(yù)處理后的待測(cè)樣本（最終樣本稀釋倍數(shù)為5倍），加樣時(shí)將液體直接加到孔底，避免觸碰孔壁，輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板混勻。

4、溫育孵育?：除空白孔外，所有孔中各加入HRP標(biāo)記的CTSC檢測(cè)抗體100μL，用封板膜覆蓋酶標(biāo)板，置于37℃恒溫箱中避光孵育60分鐘，讓抗原抗體充分結(jié)合形成穩(wěn)定的三明治免疫復(fù)合物。

5、洗板操作?：棄去孔內(nèi)所有反應(yīng)液體，在干凈吸水紙上充分拍干，每孔加滿350μl提前配制好的1×洗滌工作液，靜置浸泡1分鐘后甩干液體，重復(fù)洗板操作5次，最后一次洗板后拍干孔內(nèi)所有殘留液體，洗板不充分會(huì)直接導(dǎo)致背景本底異常升高，信噪比大幅下降。

6、底物顯色反應(yīng)?：每孔依次加入TMB底物A液、TMB底物B液各50μL，輕輕晃動(dòng)混勻，置于37℃恒溫箱中避光顯色15分鐘，此時(shí)孔內(nèi)液體逐步變?yōu)榫鶆虻乃{(lán)色，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品最高濃度孔出現(xiàn)明顯的深藍(lán)色梯度時(shí)即可終止顯色，避免顯色過度導(dǎo)致高濃度孔信號(hào)溢出。

7、終止與讀數(shù)?：每孔加入終止液50μL，輕輕晃動(dòng)混勻，藍(lán)色液體立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，加入終止液后15分鐘內(nèi)，以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下依次測(cè)定各孔的OD吸光度值，讀數(shù)前確認(rèn)酶標(biāo)儀充分預(yù)熱穩(wěn)定，避免讀數(shù)延遲導(dǎo)致數(shù)值漂移。

♀結(jié)果計(jì)算方法

1、所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的OD值先扣除空白孔的本底OD值，得到校正后的有效吸光度值。

2、以標(biāo)準(zhǔn)品的CTSC濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的校正OD值為縱坐標(biāo)，使用四參數(shù)邏輯曲線擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，要求擬合相關(guān)系數(shù)R²≥0.99，確保標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系合格。

3、將待測(cè)樣本的校正OD值代入回歸方程，計(jì)算得到樣本中CTSC的濃度，再乘以樣本的初始稀釋倍數(shù)，即可得到樣本中CTSC的實(shí)際原始濃度。若樣本OD值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)，需用樣本稀釋液對(duì)樣本進(jìn)行進(jìn)一步稀釋后重新檢測(cè)，最終結(jié)果乘以新的稀釋倍數(shù)。

?CTSC靶標(biāo)專屬關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1、樣本采集后必須在30分鐘內(nèi)完成低溫離心分離，長(zhǎng)時(shí)間室溫放置會(huì)導(dǎo)致CTSC從溶酶體中大量釋放，同時(shí)發(fā)生自降解，最終檢測(cè)結(jié)果失真。

2、不同批號(hào)的試劑盒組分絕對(duì)不能混用，超過保質(zhì)期的試劑禁止使用，否則會(huì)直接破壞抗原抗體結(jié)合體系，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

3、洗板操作必須充分，每孔洗滌液充滿微孔后靜置1分鐘再甩出，洗板不充分會(huì)直接導(dǎo)致背景本底異常升高，定量結(jié)果偏差超過20%。

4、實(shí)驗(yàn)全程避免強(qiáng)光直射HRP標(biāo)記抗體和TMB底物，強(qiáng)光照射會(huì)直接破壞HRP酶的空間構(gòu)象，導(dǎo)致酶活性大幅下降，顯色信號(hào)系統(tǒng)性偏低。

?核心科研應(yīng)用場(chǎng)景

本試劑盒目前廣泛應(yīng)用于多個(gè)前沿科研領(lǐng)域：

l 炎癥免疫研究：CTSC是中性粒細(xì)胞絲氨酸蛋白酶激活的核心上游調(diào)控因子，試劑盒可精準(zhǔn)檢測(cè)炎癥性腸病、慢性阻塞性肺疾病等炎癥模型中CTSC的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化，揭示炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活機(jī)制。

l 腫瘤轉(zhuǎn)移研究：CTSC在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，試劑盒可用于腫瘤患者血清中可溶性CTSC的定量檢測(cè)，探索其作為新型腫瘤生物標(biāo)志物的臨床潛力。

l 藥物研發(fā)篩選：針對(duì)CTSC的特異性抑制劑是新一代抗炎、抗腫瘤藥物的研發(fā)熱點(diǎn)，試劑盒可用于藥物篩選過程中細(xì)胞上清、動(dòng)物血清中CTSC的活性定量，評(píng)估抑制劑的體內(nèi)外藥效。

l 罕見病機(jī)制研究：CTSC功能缺失突變是導(dǎo)致掌跖角化病等遺傳性疾病的核心病因，試劑盒可用于患者樣本中CTSC蛋白表達(dá)水平的精準(zhǔn)定量，輔助罕見病的分子機(jī)制研究。