PCR 全稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction），指利用 Taq 和/或 Pfu 核酸酶驚醒的體外特異性擴(kuò)增某特定核算序列

Rt-PCR 一般指反轉(zhuǎn)錄 PCR （Reverse Transcription PCR）其實(shí)就是將 PCR 與反轉(zhuǎn)錄結(jié)合，這樣就可以獲得多克隆的某一特異的 RNA 片段（通常是 mRNA）。首先將提取的 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA ，之后與常規(guī) PCR 一致。引物與常規(guī) PCR 沒有太大不同（序列特異性引物或隨機(jī)引物）有時(shí)候會(huì)用 mRNA 的特異性引物 Oligo dT （針對(duì) mRNA 的標(biāo)志性 poly - A 尾）。通常Rt-PCR 是為了分析細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)情況，會(huì)以細(xì)胞中自然表達(dá)的 beta-actin 作為內(nèi)參分析蛋白質(zhì)表達(dá)情況（beta-actin 認(rèn)為是管家基因，在同種細(xì)胞中表達(dá)恒定）

qPCR 指熒光實(shí)時(shí)定量 PCR （Quantitative real-time PCR），有時(shí)也會(huì)被稱作實(shí)時(shí)/定量 PCR （Rt-PCR）。qPCR 使用一種特殊的探針—— Taqman 探針，其結(jié)構(gòu)為一個(gè) RNA 探針，兩端分別加上一個(gè)發(fā)光基團(tuán) R 和一個(gè)吸光基團(tuán) Q 。而且 qPCR 不使用 Taq 聚合酶，因?yàn)?Taq 缺乏其他 DNA 聚合酶擁有的 5' - 3' 外切酶結(jié)構(gòu)域及其即時(shí)矯正機(jī)制。

簡單說，就是 rt 和 q 都是常規(guī) PCR 的變種。

此時(shí) R 與 Q 同在探針上，距離較近，R 產(chǎn)生的熒光被 Q 吸收，所以不顯出熒光；當(dāng)互補(bǔ)鏈 DNA 合成時(shí)，DNA 聚合酶向下游移動(dòng)，其 5' - 3' 外切酶結(jié)構(gòu)域就會(huì)切割探針，依次釋放出 R 和 Q。自由的 R 與 Q 距離較遠(yuǎn)，互相之間沒有互作，所以不會(huì)影響 R 的熒光。

定義新參數(shù) Ct 值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。閾值通常設(shè)定為 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍（為什么這么設(shè)定？可能只是約定俗成吧……我不了解）。Ct 值由實(shí)驗(yàn)獲得。

每個(gè)模板的 Ct 值與該模板的起始濃度的對(duì)數(shù)存在相關(guān)性（具體推導(dǎo)過程我忘了……），即：

n 為擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行的輪數(shù)，X 為初始模板量，Ex 為擴(kuò)增效率（通常不考慮，作為常數(shù)看待），N 為熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。

顯然 X 的對(duì)數(shù)值與 Ct 值為負(fù)相關(guān)。利用已知 X 的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線（有效地避免了對(duì) Ex 的討論），以 lgX 為橫坐標(biāo)，Ct 為縱坐標(biāo)。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

注：qPCR 還有一種 SYBRGreenⅠ法，但是本人比較熟悉 Taqman 法，所以就懶得講另外一個(gè)了，而且 SYBRGreenⅠ法感覺也比較簡單易懂，如果題主還有疑問我再寫吧……

再注：不同的 PCR 方法是可以搭配使用的，qPCR + rtPCR 通常稱為 rt-qPCR，以避免與 qPCR 全稱混淆。