人細(xì)胞株操作方法：

（1）取成年新西蘭大白兔，耳緣靜脈注射空氣處死后，取下兔子的雙腿，立即用75%乙醇浸泡。

（2）移入細(xì)胞房?jī)?nèi)，去除雙腿表面的皮毛及肌肉，剪取關(guān)節(jié)段，移至超菌工作臺(tái)內(nèi)。

（3）PBS洗滌數(shù)次，用手術(shù)刀或彎剪將關(guān)節(jié)表面的軟骨組織取下。

（4）軟骨組織塊靜置5min，棄去上層液體及懸浮組織，將軟骨組織剪成1mm3的大小。移到離心管中加3倍體積的0.25%胰蛋白酶，置入37℃的恒溫?fù)u床中，振蕩消化15-20min；

（5） 4℃靜置5min；棄上清，PBS洗滌，去上清。加入0.2%膠原酶II，置入37℃的恒溫?fù)u床中，振蕩消化2H；
（6）加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打后依次通過(guò)200目濾網(wǎng)。收集濾液,1200rpm離心8min，棄上清，用DMEM*培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞, 放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

（7）細(xì)胞傳代后放入預(yù)置有薄骨片或蓋玻片的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞*展開(kāi)后即可固定做原代鑒定。

人細(xì)胞株培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。