流式細(xì)胞術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題說(shuō)明

上海撫生將進(jìn)一步加強(qiáng)人才經(jīng)營(yíng)、產(chǎn)品經(jīng)營(yíng)，不斷提升企業(yè)的核心竟?fàn)幜?，?shí)現(xiàn)具有產(chǎn)業(yè)體系、知識(shí)化創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)的化的公司，服務(wù)于生命科學(xué)領(lǐng)域，迎接世界經(jīng)濟(jì)一體化所帶來(lái)的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。小編解答 流式細(xì)胞術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題說(shuō)明及方法。

1、流式細(xì)胞儀上的FL2-W FL2-A FL2-H 分別是做什么的？

FL2-W是只檢測(cè)熒光的脈沖寬度， FL2-H是指脈沖高度。通常在做細(xì)胞周期分析時(shí)應(yīng)用，用于去除粘連細(xì)胞。

2、流式同型對(duì)照怎樣選擇？

同型對(duì)照（Isotype Control）：使用與一抗相同種屬來(lái)源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用an normal serum（與一抗相同的正常血清） （must be the same species as primary antibody）。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.這個(gè)可以咨詢?cè)噭┥獭Ｍ蛯?duì)照為免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì)照。由于熒光標(biāo)記單抗的組來(lái)源不同，應(yīng)選用相同來(lái)源的未標(biāo)記單抗作為同型對(duì)照來(lái)調(diào)整背景染色。舉個(gè)例子：比如檢測(cè)一抗為單抗的mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a， 所以可以用purified（純化的） mouse IgG2a來(lái)做OX-42的同型對(duì)照（Isotype Control）。一般的的生物技術(shù)公司和國(guó)內(nèi)的代理都有出售。

同型對(duì)照：是指與MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亞類，若使用直接免疫熒光染色法，同型對(duì)照也應(yīng)標(biāo)記熒光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。主要考慮了細(xì)胞的自發(fā)熒光、FC受體介導(dǎo)的抗體結(jié)合和非特異性抗體結(jié)合等影響因素。此外，同型對(duì)照與MoAb所標(biāo)記的熒光色素、濃度、F：P比值（標(biāo)記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值）應(yīng)該相同為*，這對(duì)準(zhǔn)確設(shè)定陰性與陽(yáng)性細(xì)胞的界標(biāo)有重要意義，切忌使用與MoAb不相匹配的同型對(duì)照，為同一實(shí)驗(yàn)室、采用相同工藝或方法制備（如同一品牌）的產(chǎn)品。

3、流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度為何要使用氯化鈣？

在文獻(xiàn)及其他專業(yè)網(wǎng)zhan中都有測(cè)定游離鈣的方法，具體如下：

（1） 鈣熒光探針負(fù)載；

（2）隨機(jī)測(cè)定每管細(xì)胞懸液樣品（以下簡(jiǎn)稱樣品）的單個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，記為F值。

（3）加入10%Triton X 100，（破膜用）；加入1 mmol/L氯化鈣，（問(wèn)題所在），吹打均勻，孵育1~10min，測(cè)定熒光即Fmax值。

（4）加入EGTA，20%26mu;l（鈣螯合劑），孵育1~10min，激發(fā)波長(zhǎng)488nm測(cè)定熒光，即Fmin值。

因?yàn)檎Ｑ獫{中Ca2＋濃度是1mM，細(xì)胞外液的Ca2＋對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋有影響。加0.1%triton是增加膜通透性，使細(xì)胞外Ca2＋進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，作為大值。加EGTA是為了螯合Ca2＋，作為小值.環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度遠(yuǎn)低于細(xì)胞外液（大約1：10000），細(xì)胞膜對(duì)鈣的通透性變化對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣影響很大。