色譜填料又稱為“層析介質(zhì)”，是色譜技術(shù)的核心關(guān)鍵，對分離純化的結(jié)果和效率起著至關(guān)重要的作用，特別在生物制藥領(lǐng)域，生產(chǎn)環(huán)節(jié)下游需通過分離純化提高產(chǎn)品的純度和收率，保障產(chǎn)品質(zhì)量和穩(wěn)定性。因此，生物制藥生產(chǎn)效率的提高與生產(chǎn)成本的降低，離不開下游分離純化工藝的突破創(chuàng)新，其中色譜填料/層析介質(zhì)及其工藝的發(fā)展起著重要的作用。
發(fā)展歷程
不同功能化的色譜填料和層析介質(zhì)是液相色譜和層析廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)。色譜或?qū)游龇蛛x效果很大程度上取決于色譜填料和層析介質(zhì)。從歷史來看，分離材料的發(fā)展是推動層析技術(shù)進步的主要因素，高性能新型色譜填料及層析介質(zhì)的不斷出現(xiàn)是色譜和層析分離和分析技術(shù)發(fā)展的有效驅(qū)動力。
圖1 分離材料的發(fā)展歷程
關(guān)于色譜技術(shù)
色譜技術(shù)是一種重要的生物物理技術(shù)，能夠分離、鑒定和純化混合物的組分，以進行定性和定量分析。蛋白質(zhì)可以根據(jù)大小和形狀、總電荷、表面上存在的疏水基團以及與固定相的結(jié)合能力等特性進行純化?；诜肿犹匦院拖嗷プ饔妙愋偷乃姆N分離技術(shù)利用親和、離子交換、疏水和體積排阻等機理。
表1 不同分離技術(shù)分離特性及應(yīng)用圖片
色譜法基于將混合物中的分子施加到表面或固體中，流體固定相(穩(wěn)定相)在流動相的幫助下移動時彼此分離的原理。對該分離過程有效的因素包括與吸附(液固)，分配(液固)相關(guān)的分子特征，以及它們分子量之間的親和力或差異。由于這些差異混合物的某些組分在固定相中停留的時間更長，它們在色譜系統(tǒng)中移動緩慢，而其他組分則迅速進入流動相，并更快地離開系統(tǒng)。
關(guān)于色譜填料
色譜填料是具有納米孔道結(jié)構(gòu)的微球材料，粒徑在微米尺度，而填料上的納米孔道孔徑大小在5-200 nm范圍內(nèi)。色譜填料的性能取決于其形貌、結(jié)構(gòu)、粒徑大小和分布、孔徑大小和分布、材質(zhì)組成及表面功能基團。從結(jié)構(gòu)來看主要由基質(zhì)和官能團兩部分組成，其中基質(zhì)是支撐填料的固體部分，使填料具有一定的形狀，官能團固定或結(jié)合在其上形成色譜填料，決定了分離模式和分離選擇性。
色譜填料的基質(zhì)主要可分為無機介質(zhì)與有機聚合物，其中有機聚合物又包括天然聚合物和合成聚合物?；|(zhì)材料通常為親水性固體材料，且易于化學(xué)修飾，可易于蛋白質(zhì)進入的孔隙，用于蛋白自吸附的高表面積，以及優(yōu)異的化學(xué)和物理穩(wěn)定性。目前主流包括無機介質(zhì)的硅膠(二氧化硅)以及有機介質(zhì)的天然聚合物(瓊脂糖等)和合成聚合物(聚苯乙烯等)見表2。
基體通常是球形的，也有無定形的。色譜分離對于填料的物理性質(zhì)有多方面要求:具備合適的大小和較窄的粒度分布范圍，具備一定的機械強度，有一定的孔徑大小和良好的孔徑分布，溶脹或收縮現(xiàn)象不能超出所允許的限制范圍，親水性質(zhì)等。這些物理性質(zhì)主要取決于基體。
表2 色譜填料基質(zhì)材料分類
純化策略
近年來，色譜技術(shù)進入了高速發(fā)展期，成為了蛋白質(zhì)分離純化領(lǐng)域中重要的一種手段。尤其是生物技術(shù)產(chǎn)品，包括了疫苗、生長激素、凝血因子等。隨著后基因組計劃的實施，各種在細菌、酵母、昆蟲細胞以及對于哺乳動物細胞等表達系統(tǒng)中開發(fā)的基因重組藥物，自然界低豐度蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)等，都對色譜純化技術(shù)提出了更高的要求。
下游加工工藝從細胞或培養(yǎng)基收獲開始。各種表達系統(tǒng)中雜質(zhì)的多樣性對純化策略至關(guān)重要。經(jīng)過破碎澄清后的粗提物中包含載體、細胞宿主碎片、蛋白質(zhì)、基因組DNA、血清蛋白、培養(yǎng)基的部分成分、輔助DNA或輔助病毒等成分。這些雜質(zhì)可能毒害細胞，降低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，甚至誘發(fā)全身免疫反應(yīng)或炎癥反應(yīng)。目的產(chǎn)物的純度、功效和安全標準受到監(jiān)管機構(gòu)嚴格的審查。在整個純化過程中還需盡可能保持病毒活性完整，考慮到病毒顆粒復(fù)雜而脆弱的結(jié)構(gòu)，研究人員們需根據(jù)不同的產(chǎn)品開發(fā)相對應(yīng)的下游純化策略。
在開始純化蛋白質(zhì)之前，我們應(yīng)首先了解所純化蛋白質(zhì)的用途、純度、所需的濃度以及儲存條件。在設(shè)計和確定一個經(jīng)濟、省時且能進行大量目的蛋白純化的方案時，所有因素都是至關(guān)重要的。FDA批準的適用于臨床試驗的產(chǎn)品純化工藝依賴于商業(yè)規(guī)模的工藝。優(yōu)化的純化工藝克服了產(chǎn)品生產(chǎn)對人類治療研究和藥物制備的瓶頸。未來成熟高效的下游純化策略需要更高效的色譜技術(shù)作為支撐。
色譜填料國產(chǎn)化進程
生物藥生產(chǎn)主要耗材包括上游發(fā)酵和下游純化兩部分，上游工藝隨微生物發(fā)酵工程相關(guān)技術(shù)進步和培養(yǎng)基等主要原材料的國產(chǎn)化，成本占比已降至30%或更低，而下游純化，由于國產(chǎn)化替代推進較慢，成本占比高達70%左右。國內(nèi)由于相關(guān)材料研發(fā)以及生產(chǎn)制造起步較晚，目前產(chǎn)業(yè)實現(xiàn)自產(chǎn)的企業(yè)較少，但經(jīng)過多年的發(fā)展，國產(chǎn)填料技術(shù)與品質(zhì)已大幅改善，部分產(chǎn)品的性能已達到甚至超越進口產(chǎn)品水平。
在產(chǎn)品質(zhì)量達標的前提下，國產(chǎn)填料廠商在市場響應(yīng)和價格方面具備較大優(yōu)勢。境外色譜填料廠商供貨周期普遍較長，對比來看國內(nèi)廠家的供貨周期一般為2周左右，在時效性方面具備明顯優(yōu)勢；國內(nèi)企業(yè)在客戶溝通和技術(shù)支持方面相比境外填料廠商速度也更快。此外考慮到國內(nèi)藥物領(lǐng)域的競爭以及醫(yī)保談判、國家集采等藥政的影響，下游生產(chǎn)企業(yè)對成本的敏感性也將大幅提升，國產(chǎn)填料具備突圍的充分條件。
結(jié)論
在高技術(shù)材料領(lǐng)域，研發(fā)生產(chǎn)經(jīng)驗積累后的產(chǎn)品升級迭代是鞏固競爭力的必然之舉。百林科醫(yī)藥科技(上海)有限公司經(jīng)多年的努力已形成全面的產(chǎn)品矩陣，為精益求精、重點領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)追趕和反超國際水平，公司每年持續(xù)較多投入研發(fā)費用開發(fā)新產(chǎn)品，其目的均為在現(xiàn)有水平上進一步進行優(yōu)化改善，以達到或者超過國外產(chǎn)品水平。目前百林科已成功推出全品類層析填料產(chǎn)品，并已在國內(nèi)多家客戶處成功應(yīng)用。
表3 百林科色譜填料產(chǎn)品概覽
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參考文獻
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