隨著精準化醫(yī)療的理念逐漸深入人心，越來越多的治療用生物制品如雙特異性抗體、抗體偶聯(lián)化藥(ADC)以及細胞治療(CAR-T)獲批上市。同時越來越多制藥企業(yè)布局生物藥管線，使得治療用生物制品研發(fā)競爭越來越激烈。因此在早期研發(fā)階段采取合適的工藝開發(fā)策略有利于縮短研發(fā)時間、節(jié)約研發(fā)成本，具有很高的競爭力。
 

　　本文綜述了生物制品下游純化常用層析方法(親和、離子交換、疏水、凝膠過濾、多模式)填料篩選策略，可助力下游純化的快速工藝開發(fā)。
 

　　在設(shè)計生物制品下游純化流程前首先需要明確純化工藝過程的目的，如收率與純度的平衡、雜質(zhì)殘留率等。此外還應(yīng)該對目標產(chǎn)物性質(zhì)進行充分評估，例如：該目標產(chǎn)物的分子量、等電點、結(jié)構(gòu)特征、親和力特征等。最后，還應(yīng)該充分考察目標產(chǎn)物的穩(wěn)定性如酸堿穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性以及可溶解性等，從而初步確定純化過程中溫度以及緩沖體系的選擇。目的產(chǎn)物充分了解之后可以選擇合適的層析模式進行填料篩選以及優(yōu)化。
 

　　01　親和層析
 

　　親和層析是一種選擇性的純化方法，以兩個分子間高度特異性的生物相互作用為基礎(chǔ)，從復(fù)雜體系中捕獲目標分子。因此選用親和層析來進行純化時，需要先對目標產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)以及親和力位點進行充分評估。例如，一些重組蛋白會在載體構(gòu)建階段引入組氨酸標簽，可以選用含鎳離子的親和填料進行捕獲；含有GST標簽的重組蛋白，則可選用谷胱甘肽親和層析法。而對于治療性抗體(單抗、雙抗以及多抗)的捕獲，通常需要依據(jù)抗體結(jié)構(gòu)來進行選擇。例如，對于含有完整抗體結(jié)構(gòu)的抗體(含有Fc區(qū)域)，通?？梢赃x用protein A以及protein G親和層析來進行捕獲。
 

　　在選定親和層析填料類型之后，可以選擇3-4款該類型親和填料(可依據(jù)填料基架適用性、價格可及性以及供貨周期挑選)進行篩選，對于親和層析來說，由于目標分子與填料配基通過特異性相互作用結(jié)合，因此親和層析裝柱子時對稱因子只需要保持在0.8-1.8即可。此外還可選用平臺化的親和層析方法來對填料進行篩選，例如，鎳離子親和層析通常選用250 mM的咪唑來洗脫目標產(chǎn)物；而選用protein A 親和填料純化抗體蛋白時，則通常選用pH 3.0-4.0的條件洗脫目標抗體。采用平臺化的層析方法后，可對目標產(chǎn)物的收率以及純度進行檢測，通常來說初篩親和層析填料的收率可達到85%以上，SEC純度可達到80%以上。
 

　　依據(jù)最初設(shè)定的目標可進一步進行填料優(yōu)化。在選定填料后，可結(jié)合相應(yīng)的DOE實驗設(shè)計，對上樣(上樣樣品的pH、cond、以及上樣載量)、淋洗(去除雜質(zhì))、洗脫等工藝參數(shù)進行進一步優(yōu)化。
 

 

親和層析原理圖

 

　　02　離子交換層析
 

　　離子交換層析是一種依據(jù)目標產(chǎn)物與雜質(zhì)電荷差異而分離的純化方式，通常用在目標產(chǎn)物的精純階段。根據(jù)交換離子的不同可分為陰離子交換層析和陽離子交換層析。根據(jù)層析目的的不同，離子交換層析過程可選用兩種模式：(1)流穿模式：目標產(chǎn)物與填料不結(jié)合，而盡量將雜質(zhì)結(jié)合在層析填料上；(2)結(jié)合洗脫模式：目標產(chǎn)物與填料結(jié)合，再使用一定濃度的鹽進行洗脫。選用合適的層析填料以及層析模式，首先就要明確層析目的以及目標產(chǎn)物的等電點PI(電荷性質(zhì))，目標產(chǎn)物的PI可以通過目標產(chǎn)物序列計算獲得(理論等電點)，也可以通過毛細管等電聚焦電泳(CIEF)來獲得(實際等電點)。
 

　　對于等電點低于目標產(chǎn)物等電點的雜質(zhì)，可選用陰離子層析-流穿模式進行純化。采用這種層析模式，需要將緩沖體系的pH調(diào)節(jié)在目標產(chǎn)物以及雜質(zhì)的等電點之間(高于雜質(zhì)等電點，低于目標產(chǎn)物等電點)。因此目標產(chǎn)物會帶上正電，在層析過程中可以通過收集流穿液來進行純化，而雜質(zhì)在該條件下則會帶上負電并與陰離子填料結(jié)合，需通過再生模式進行去除。此外，采用流穿模式還可以有效去除目標產(chǎn)物中帶負電的病毒顆粒。對于流穿模式的填料篩選，通?？蛇\用實驗設(shè)計(DOE)結(jié)合96孔板的方式進行高通量篩選?？疾煲蛩乜蓮奶盍匣?通常分為硬膠和軟膠，其中硬膠更加耐壓；而軟膠則親水性好，特異性吸附小)、填料粒徑(粒徑越小分辨率越高，但是反壓較大；反之粒徑越大分辨率越低，但是更加耐壓)以及填料載量(通常采用流穿模式的層析載量會較大，一般高于50 g/L)等角度入手進行試驗篩選，并結(jié)合收率及質(zhì)量屬性進行效果評估。
 

　　對于等電點高于目標產(chǎn)物等電點的雜質(zhì)，通常可采用陽離子-結(jié)合洗脫的層析模式進行純化。這種層析模式通常采用鹽濃度梯度洗脫的方式對目標產(chǎn)物進行填料篩選、雜質(zhì)淋洗以及洗脫鹽濃度的初步探索。其次依據(jù)梯度洗脫的實驗結(jié)果，結(jié)合實驗設(shè)計(DOE)的策略將梯度實驗的結(jié)果優(yōu)化為步級洗脫，并驗證其質(zhì)量屬性。對于結(jié)合洗脫模式的填料篩選，柱層析篩選的方式，因為結(jié)合洗脫模式填料的篩選如果通過96孔板板篩，通常需要12-24小時才能充分結(jié)合，難以實現(xiàn)高通量篩選。此外，對于采用結(jié)合洗脫模式填料的篩選更應(yīng)該關(guān)注填料的粒徑、淋洗以及洗脫時所需的鹽濃度(通常生物制品在高鹽環(huán)境下不穩(wěn)定，也不利于后續(xù)的分析檢測)等因素，并且考察相對應(yīng)的收率和質(zhì)量屬性。
 

 

離子交換原理圖

 

　　03　疏水層析
 

　　疏水層析是根據(jù)目標產(chǎn)物與雜質(zhì)之間疏水性差異進行純化的層析模式。通常來說疏水層析主要應(yīng)用于高分子量聚體的去除。由于很難直接獲得目標產(chǎn)物的疏水性特征，因此在設(shè)計疏水層析工藝時首先要用含不同疏水性配基的填料進行預(yù)實驗，通常來說疏水性配基丁基-辛基-苯基的疏水性依次遞增，通過和不同的疏水性填料進行結(jié)合吸附試驗，可對目標產(chǎn)物的疏水性有一個預(yù)判。對目標產(chǎn)物疏水性有大致了解后，應(yīng)進行目標產(chǎn)物的預(yù)處理，通常來說目標產(chǎn)物會在高鹽體系下與疏水性填料進行結(jié)合，在低鹽條件下進行洗脫。因此需要優(yōu)化層析過程上樣時的鹽濃度(通常選用硫酸銨作為上樣預(yù)處理的鹽)。此外，初步確定配基種類和上樣所需的鹽濃度后，可以采用從高鹽到低鹽梯度洗脫的方式進行填料篩選和工藝優(yōu)化。后續(xù)可以通過實驗設(shè)計進一步優(yōu)化為步級洗脫。
 

 

疏水色譜原理圖

 

　　04　凝膠過濾層析
 

　　凝膠過濾層析(又稱分子篩)，是一種依據(jù)分子量大小而進行分離純化的層析模式。在進行分子篩層析工藝開發(fā)和填料篩選階段，首先要對目標產(chǎn)物以及雜質(zhì)的分子量有個大致了解。目標產(chǎn)物以及雜質(zhì)的分子量可以通過凝膠電泳(SDS-PAGE)以及毛細管電泳(CE-SDS)來獲得。對于分子篩填料的篩選來說,主要應(yīng)當關(guān)注填料的孔隙直徑范圍，通常來說孔隙直徑越大分離的范圍也就越大，例如75 pg的孔隙較小，填料分離范圍在3~70KDa，而200 pg的孔隙較大，填料分離范圍在10~600KDa，因此首先需要根據(jù)純化需求選擇合適的填料。此外還應(yīng)該關(guān)注填料對目標產(chǎn)物的特異性吸附作用，應(yīng)盡可能減少目標產(chǎn)物與填料的特異性吸附。
 

 

凝膠過濾層析示意圖

 

　　05　多模式層析
 

　　近年來有多家填料供應(yīng)商開發(fā)出多模式填料，目前主流的多模式填料有陽離子+疏水以及陰離子+疏水。多模式層析結(jié)合了離子交換高分辨率的同時，結(jié)合了疏水層析高耐鹽的特性，使得層析過程可以在高鹽的條件進行上樣，從而有更高的可操作空間，適合復(fù)雜樣品的純化。多模式層析填料的篩選應(yīng)當注意目標產(chǎn)物的疏水性，對于疏水性較高的目標產(chǎn)物容易出現(xiàn)難以洗脫的情況(疏水性較高時，離子力以及疏水力的雙重作用使得目標產(chǎn)物與填料結(jié)合較為牢固難以洗脫，而采用高鹽洗脫時會導(dǎo)致填料的疏水性占主導(dǎo)從而導(dǎo)致收率較低的情況)，因此對于疏水性較強的目標產(chǎn)物應(yīng)當選用配基密度較低的填料，或者在層析過程中添加精氨酸來削弱疏水力進行工藝開發(fā)。對于疏水性適中的目標產(chǎn)物則可以通過一系列梯度實驗進行填料篩選和工藝開發(fā)(例如，單一鹽梯度，單一pH梯度，在一定鹽濃度下拉pH梯度，在一定pH下拉鹽梯度，以及鹽和pH雙梯度)。
 

 

　　本文綜述了親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析以及多模式層析在生物制品下游純化的應(yīng)用范圍，并且簡述了不同層析模式填料的篩選策略，期望為各大生物制品下游研發(fā)團隊提供工藝開發(fā)思路，助力生物制品的下游工藝開發(fā)。
 

 

  

 

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　　參考文獻