目前百林科除了可以提供上游質(zhì)粒發(fā)酵的一次性解決方案，從大腸收獲，裂解，純化等工藝步驟提供系統(tǒng)的解決方案，具體如下圖：
圖1 百林科在質(zhì)粒上的整體解決方案
上游通過大腸桿菌表達菌體，通過菌體收獲，下游的裂解工藝，澄清過濾、濃縮工藝，層析純化工藝可以獲得高純度的超螺旋DNA(scDNA)。下面從裂解以及澄清和層析等方面做重點的解析：
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裂解工藝策略：大腸桿菌的裂解通常會采用堿裂解的方法進行，操作方法簡單，經(jīng)濟。在大腸桿菌的菌體裂解時釋放大量的RNA、線性DNA，開環(huán)質(zhì)粒(ocDNA)及宿主蛋白(HCP)、宿主核酸(HCD)、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)給后續(xù)的超螺旋質(zhì)粒的純化帶來極大的挑戰(zhàn)。堿裂解工藝可通過優(yōu)化菌體的懸浮比例，裂解比例，裂解時長，中和比例和時間等參數(shù)，減少雜質(zhì)的產(chǎn)生，提高裂解效率。百林科可以提供相應(yīng)的Mixer 作為裂解設(shè)備來滿足GMP生產(chǎn)階段的需求。
圖2：百林科用于質(zhì)粒裂解的設(shè)備
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澄清過濾：根據(jù)工藝需要一般選用10~50μm的除絮狀沉淀和0.45μm孔徑的濾器進行二級澄清過濾或0.2μm的中空纖維膜進行澄清過濾，收集的澄清液進行TFF濃縮換液。澄清過濾可通過優(yōu)化濾器材質(zhì)，濾器的膜過濾載量，膜通量；0.2μm的中空纖維膜可選擇百林科的TFFNOVA®系列的中空纖維柱，目前在大腸的裂解澄清液中能達到平均30LMH的處理通量。
圖3：百林科中空纖維以及在大腸澄清上的應(yīng)用
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濃縮工藝策略：超濾濃縮可以去除RNA，HCP等其他雜質(zhì)，所需上樣體積。濃縮換液以優(yōu)化膜包或者中空纖維的材質(zhì)、孔徑，濃縮倍數(shù)，TMP控制，剪切力控制，提高工藝的重復(fù)性和可放大性。
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層析純化工藝開發(fā)策略：目前質(zhì)粒層析工藝Chromstar 6FF+MaXtar PlasmidCap HR+MaXtar Q HR三步法最為經(jīng)典常用，針對不同的質(zhì)粒產(chǎn)品和用戶需求，百林科也有不同的質(zhì)粒產(chǎn)品純化策略，例如可以使用BaronCHT Type II去除HCD和ocDNA，或者使用CaCl2或硫酸銨沉淀樣品后使用MaXtar Q+MaXtar PlasmidCap HR/ BaronCHT Type II兩步層析純化超螺旋質(zhì)粒。
圖4：百林科純化質(zhì)粒的工藝路線
下面我們以經(jīng)典的三步法
做純化工藝的分享
第一步分子篩層析：
根據(jù)目標產(chǎn)物與雜質(zhì)的分子量差異和分子構(gòu)象差異，通過優(yōu)化上樣體積與濃度，流速，柱高等因素，主要去除HCP，HCD及RNA等雜質(zhì)。
推薦使用: 百林科 Chromstar 6FF
推薦buffer 體系： 2.1 mol/L (NH4)2SO4+50mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA，pH=7.3~7.7
圖5：Chromstar 6FF在質(zhì)粒純化的效果
質(zhì)粒親和層析
根據(jù)利用PlasmidCap配基的嗜硫吸附及親水-疏水混合模式作用，可去除結(jié)合能力較弱的線性DNA，ocDNA，主要通過上樣載量，保留時間，上樣與洗脫的pH及電導(dǎo)的優(yōu)化，提高超螺旋DNA比例。
推薦使用：百林科 MaXtar PlasmidCap HR
推薦buffer 體系：
EQ Buffer：1.9 mol/L (NH4)2SO4+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA，pH=7.3~7.7
Elution Buffer：1.7 mol/L (NH4)2SO4+0.3 M NaCl+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA，pH=7.3~7.7
圖6：MaXtar PlasmidCap HR在質(zhì)粒上的應(yīng)用(去除OcDNA)
陰離子交換層析
依據(jù)不同電荷的分子保留強弱的不同，達到去除內(nèi)毒的目的。主要通過上樣載量，保留時間，洗脫電導(dǎo)和pH的優(yōu)化，高純度，低工藝雜質(zhì)的超螺旋質(zhì)粒。
推薦使用：百林科 MaXtar Q HR
推薦Buffer 體系：
EQ Buffer：0.4 M NaCl+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA，pH=7.3~7.7
Elution Buffer：0.8 M NaCl+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA，pH=7.3~7.7
圖7：MaXtar Q HR在質(zhì)粒上的應(yīng)用
客戶使用百林科三步層析法純化質(zhì)粒的結(jié)果匯總：
如果遇到一些質(zhì)粒的聚集體等的去除可以嘗試CHT的純化方案。CHT是一種無機純相層析介質(zhì)，高溫焙燒成球體，可同時實現(xiàn)陽離子交換和鈣金屬親和混合分離模式，在去除聚集體和HCD方面具體的優(yōu)勢。
CHT在超螺質(zhì)粒純化去除HCD及scDNA，優(yōu)化上樣及洗脫條件可獲得更高純度的超螺旋質(zhì)粒。
圖8：BaronCHT Type II在質(zhì)粒純化上的應(yīng)用(7.7 mm×100 mm，4.7mL/CV)
兩步層析純化
菌體裂解液繼續(xù)超濾濃縮后的樣品，經(jīng)過CaCl2或硫酸銨沉淀后質(zhì)粒樣品可以，經(jīng)過離子交換層析和親和層析結(jié)合純化超螺質(zhì)粒，推薦MaXtar Q HR + MaXtar PlasmidCap HR ，通過優(yōu)化上樣，洗脫等工藝條件，可獲得理想的超螺旋質(zhì)粒?；蛘進aXtar COLL 700+ MaXtar PlasmidCap HR的方案，其中COLL700是一款復(fù)合層析介質(zhì)。區(qū)別于傳統(tǒng)的層析介質(zhì)，它由兩層不同的結(jié)構(gòu)組成：外殼是多孔的鈍化層 ，確保 700KD 以上的大分子不會進孔，直接走外水流穿；核心是偶聯(lián)了同時具有疏水和吸附負電荷作用基團的球形內(nèi)核，更大程度結(jié)合宿主蛋白、 核酸等雜質(zhì)。菌體裂解液繼續(xù)超濾濃縮后的樣品，經(jīng)過COLL 700復(fù)合層析和親和層析結(jié)合純化超螺質(zhì)粒，推薦MaXtar COLL 700+MaXtar PlasmidCap HR，通過優(yōu)化上樣，洗脫等工藝條件，可獲得理想的超螺旋質(zhì)粒。
目前有較多客戶與百林科在質(zhì)粒上進行方案的合作，歡迎大家掃碼聯(lián)系我們當?shù)氐匿N售與技術(shù)人員。
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